WWW.NEW.PDFM.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Собрание документов
 

«Пятницкий Илья Алексеевич Фотоиндуцированная агрегация продуктов фотоокисления псоралена и механизмы их иммуносупрессорного действия Диссертация на соискание ученой степени ...»

1

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего

профессионального образования «Российский национальный

исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова»

Минздрава России

На правах рукописи

Пятницкий Илья Алексеевич

Фотоиндуцированная агрегация продуктов фотоокисления псоралена и

механизмы их иммуносупрессорного действия

Диссертация на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

03.01.02 – Биофизика

14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология

Научный руководитель д.м.н., профессор А.А. Кягова Москва 2014

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5

ВВЕДЕНИЕ 6 Глава 1 . ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Строение и фотофизические характеристики псораленов

1.2. Фотохимические реакции фурокумаринов 13

1.3. Мембранотоксические эффекты продуктов фотоокисления 15 псоралена

1.4. Общие положения теории РСР 20

1.5. Закон Бунзена-Роско 23

1.6. Современные представления о механизмах развития реакции 24 контактной чувствительности

1.7. Иммунологические эффекты ПУВА-терапии и фотофереза 34

1.8. Методы регистрации апоптоза 38

1.9. Иммунологические эффекты продуктов фотоокисления псоралена 41

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Реактивы 44



2.2. Приготовление раствора фотосенсибилизатора и его облучение 44

2.3. Изучение агрегатного состояния и фотолиза псоралена 45 оптическими методами

2.4. Приготовление суспензии эритроцитов и постановка ФОП- 46 гемолиза

2.5. Лабораторные животные, постановка реакции КЧ 47

2.6. Приготовление суспензий клеток лимфоузлов и селезенок, оценка 49 абсолютного числа клеток и пролиферации лимфоцитов в лимфатических узлах

2.7. Оценка уровня секреторных цитокинов 50

2.8. Оценка апоптоза in vivo: подготовка суспензий клеток и 51 цитометрический анализ

2.9. Оценка апоптоза in vitro 53

2.10. Иммуномагнитная сепарация 54

2.11. Статистическая обработка результатов 53

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ

ОБСУЖДЕНИЕ

3.1.АГРЕГАЦИЯ ПРОДУКТОВ ФОТООКИСЛЕНИЯ ПСОРАЛЕНА 56

3.1.1 Фотоиндуцированная агрегация псоралена, спектры РСР 56 3.1.2. Измерение спектров возбуждения и эмиссии флуоресценции 58 продуктов фотоокисления псоралена 3.1.3. Влияние тушения флуоресценции на РСР фотопродуктов 60 псоралена 3.1.4. Стабильность фотоиндуцированных агрегатов псоралена во 63 времени 3.1.5. Измерение сигналов РСР при разведении ФОП 67 3.1.6. Зависимость фотоиндуцированной агрегации псоралена от дозы 69 УФА-облучения 3.1.7. Зависимость фотоиндуцированной агрегации псоралена от 72 интенсивности УФА-излучения и концентрации псоралена во время облучения 3.1.8. Исследование спектров РСР и гемолитической активности ФОП 75 при облучении псоралена в бескислородной среде и в присутствии кислорода 3.1.9. Проверка выполнимости закона Бунзена-Роско при 82 фотоиндуцированной агрегации псоралена и при образовании ФОПгемолизинов 3.1.10. Влияние интенсивности УФА-излучения на образование ФОП- 85 гемолизинов

3.2. ИЗУЧЕНИЕ ИММУННЫХ МЕХАНИЗМОВ ОГРАНИЧЕНИЯРЕАКЦИИ КЧ ПРИ ДЕЙСТВИИ ФОП

3.2.1. Супрессорное действие ФОП на разные фазы развития реакции 88 КЧ 3 .

2.2. Действие ФОП на афферентную стадию реакции КЧ в 90 зависимости от способа его введения 3.2.3. Влияние ФОП на динамику накопления клеток в лимфоузлах и 92 селезенках ДНФБ-сенсибилизированных мышей 3.2.4. Измерение пролиферативной активности клеток лимфоузлов 95 под действие ФОП in vivo 3.2.5. Изменение цитокинового профиля клеток лимфоузлов под 97 действием ФОП in vivo 3.2.6. Индукция апоптоза клеток ЛУ продуктами фотоокисления 100 псоралена in vivo и in vitro 3.2.7. Выполнимость закона Бунзена-Роско для проапоптотического 109 действия ФОП на клетки лимфоузлов интактных мышей 3.2.8. Образование агрегатов продуктов ФОП при дозах, вызывающих 112 апоптоз клеток лимфоузлов мышей 3.2.9. Выявление субпопуляции Т-лимфоцитов, ответственной за 115 развитие реакции КЧ к ДНФБ 3.2.10. Выявление специфичности супрессорного действия ФОП при 118 его внутривенном введении мышам 3.2.11. Выявление популяции клеток, ответственных за супрессорное 123 действие продуктов фотоокисления псоралена ЗАКЛЮЧЕНИЕ 129 ВЫВОДЫ 132 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 133

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

–  –  –

Введение Псоралены – вещества растительного или синтетического происхождения, которые используют для фотохимиотерапии дерматозов .

Существует, по крайней мере, два основных метода терапии с использованием псораленов и УФ-А облучения светом в УФА-диапазоне области спектра (320-400 нм): ПУВА-терапия (псорален+УФА) и фотоферез .

При ПУВА-терапии УФА облучают кожу пациента предварительно получившего препарат псораленов. При фотоферезе облучению в присутствии псораленов подвергается лейкоцитарная фракция крови пациентов. Наряду с терапевтическим действием ПУВА вызывает побочные токсические эффекты, такие как гиперпигментация и эритема. Тем не менее, оба метода давно успешно используются в клинической практике для лечения патологий, обусловленных гиперреактивностью Т-клеточного звена иммунитета, например, витилиго, псориаза, аллергического контактного дерматита и др [81] .

При УФА облучении тканей пациентов в присутствии псораленов (ПУВА-воздействие) происходит фотолиз фотосенсибилизатора с образованием продуктов его фотоокисления (ФОП). В нашей лаборатории ранее было выявлено, что существуют стабильные продукты ФОП, которые, при введении их в биологические объекты, инициируют фотобиологические эффекты сходные с таковыми при ПУВА-воздействии [66]. А именно, ФОП обладал как мембранотоксическим, так и иммуномодулирующим действием .

Эти данные указывали на то, что продукты ФОП могут вносить вклад как в терапевтические, так и побочные токсические эффекты ПУВА-терапии и фотофереза .

Мембранотоксические эффекты ПУВА-воздействия чаще всего изучались на модели гемолиза эритроцитов [5]. Показано, что облучение эритроцитов в присутствии псоралена приводит к индукции гемолиза (ПУФА-гемолизу), механизм которого сильно зависел от интенсивности используемого УФА-излучения. При низкой интенсивности ПУФА-гемолиз имеет все черты, присущие коллоидно-осмотическому гемолизу, тогда как при высокой интенсивности механизм становится иным. Было высказано предположение, что основной вклад в развитие высокоинтенсивного ПУФАгемолиза вносят ФОП-продукты фотоокисления псоралена [46]. Так появилось новое направление исследований, ориентированное на изучение механизма гемолиза, индуцируемого стабильными продуктами фотоокисления псоралена (ФОП-гемолиза) .

Черты ФОП-гемолиза имеют много общего с чертами высокоинтенсивного ПУФА-гемолиза, поэтому было высказано предположение о сходности их механизмов. Интенсивные исследования в этой области привели к описанию ряда физико-химических закономерностей, присущих развитию ФОП-гемолиза, но механизм этих процессов оставался во многом неясным. Предполагалось, что мембранотоксическое действие ФОП может быть опосредовано тем, что при облучении раствора псоралена в нем образуются фотоиндуцированные агрегаты его фотопродуктов, которые и вызывают повреждение мембраны эритроцитов. Этот механизм гемолиза был назван механохимическим. Однако, прямых методов, позволяющих обнаружить такие агрегаты, ранее не существовало. В настоящее время появился метод резонансного светорассеяния (РСР), позволяющий с высокой чувствительностью выявлять агрегаты красителей. Таким образом, одна из задач настоящей работы заключалась в том, что привлекая метод РСР, ответить на вопрос – образуются ли фотоиндуцированные агрегаты псоралена и играют ли они какую-либо роль в мембранотоксическом действии ФОП .

Предполагается, что терапевтическое действие псораленовой фотохимиотерапии основано на индукции специфической иммуносупрессии .

Эти данные были получены преимущественно в моделях Т-клеточного иммунного ответа in vivo (реакции гиперчувствительности замедленного типа и контактной гиперчувствительности) [71]. В нашей лаборатории в моделях реакций КЧ и ГЗТ впервые было продемонстрировано, что ФОП модулирует (активирует/супрессирует) Т-клеточный иммунный ответ in vivo [44]. Это указывало на то, что ФОП-продукты могут вносить вклад в терапевтическое действие псораленовой фотохимиотерапии [46]. Предварительные данные показывают, что ФОП-продукты эффективны при лечении атопической экземы и псориаза [2]. На сегодня иммунные механизмы супрессорного, и, как следствие, терапевтического действия ФОП остаются не ясными. В этой связи изучение влияния ФОП-продуктов на различные этапы развития Тклеточного иммунного ответа является актуальным и может позволить приблизиться к пониманию иммуносупрессорного действия ФОП и тем самым дать предпосылки для разработки нового способа псораленовой фотохимиотерапии – ФОП-терапии. Очевидным преимуществом ФОП перед ПУВА-терапией или фотоферезом может быть тот факт, что ФОП-терапия не требует облучения тканей пациента, что позволит избежать негативных побочных эффектов воздействия УФА-света .

Цель настоящей работы:

Изучить агрегацию продуктов фотоокисления псоралена и иммунологические механизмы их супрессорного действия .

Задачи исследования:

1. Исследовать возможность обнаружения агрегации фотопродуктов псоралена методом резонансного светорассеяния, исследовать ее кинетику при разных концентрациях и интенсивностях облучения .

2. Оценить образование фотоиндуцированных агрегатов в растворах псоралена, облученных в присутствии или в отсутствие кислорода, с параллельным тестированием их гемолитической активности .

3. Исследовать динамику накопления в лимфоузлах животных ДНФБспецифических лимфоцитов, их цитокиновый профиль и пролиферативную активность при действии ФОП in vivo .

4. Оценить проапоптотическую активность ФОП in vivo и in vitro, сопоставить дозовые зависимости для ФОП-индуцированного апоптоза in vitro и ФОП-агрегации .

5. В опытах по адоптивному переносу выявить клеточные популяции, ответственные за иммуносупрессорное действие ФОП в реакции КЧ .

Научная новизна .

В данной работе впервые показано, что облучение раствора псоралена приводит к агрегации продуктов его фотоокисления. Кроме того, продемонстрировано, что величина агрегации пропорциональна концентрации и интенсивности действующего света при облучении раствора псоралена. Впервые установлены схожие закономерности между степенью агрегации ФОП и его гемолитической активностью. Указанные данные позволили предположить, что мембранотоксические эффекты ФОП могут быть следствием действия его агрегатов. Впервые установлено, что иммуносупрессорное действие ФОП является следствием угнетения пролиферативной активности лимфоцитов in vivo и in vitro, которое реализуется путем модуляции цитокинового профиля последних. Методом проточной цитофлуориметрии исследована проапоптотическая активность ФОП-продуктов in vivo и in vitro. Впервые показано, что индуцируемый ФОП-продуктами апоптоз лимфоцитов не может играть ведущую роль в иммуносупрессорных эффектах ФОП .

Научно-практическая значимость исследования Совокупность полученных результатов работы показывают, что продукты ФОП обладают иммунорегуляторными свойствами, и механизмы их иммуносупрессорного действия в некоторых чертах сходны с таковыми для традиционной псораленовой фотохимиотерапии (ПУВА-терапии и фотофереза). Выявленные механизмы иммуносупрессорного действия продуктов ФОП дают предпосылки для разработки нового способа псораленовой фотохимиотерапии (ФОП-терапии) для лечения заболеваний, обусловленных гиперреактивностью Т-клеточного звена иммунной системы .

Преимущество ФОП-терапии перед ПУВА-терапией/фотоферезом заключается в отсутствии необходимости УФА-воздействия на ткани пациента, что позволит исключить развитие различных побочных эффектов, например, эритемы или преждевременного старения кожи .

Положения, выносимые на защиту

1. Облучение раствора псоралена приводит к агрегации продуктов его фотоокисления; величина агрегации пропорциональна концентрации и интенсивности действующего света при облучении раствора псоралена .

2. Исследования агрегации продуктов фотоокисления псоралена методом РСР позволяют установить схожие закономерности между степенью агрегации ФОП-продуктов и их гемолитической активностью .

3. Иммуносупрессорное действие продуктов ФОП на реакцию КЧ обусловлено модуляцией цитокинового профиля АГ-специфических Тлимфоцитов и угнетением их пролиферативной активности .

4. Проапоптотическая активность ФОП-продуктов, по-видимому, не играет ведущей роли в проявлении иммуносупрессорных свойств последних .

Апробация результатов Материалы диссертационной работы были представлены на конгрессе Европейского общества дерматологических исследований в Будапеште, Венгрия (2009 г.) и Барселоне, Испания (2011 г.), Европейских фотобиологических конгрессах во Вроцлаве, Польша (2009 г.), Женеве, Швейцария (2011 г.), и Льеже, Бельгия (2013 г.), Съезде Российского фотобиологического общества в Шепси, РФ (2011 г.), 4-м Съезде биофизиков России в Нижнем Новгороде (2012 г.).

Работа апробирована на совместном заседании кафедры физики и математики, кафедры фармакологии и кафедры иммунологии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России 23 сентября 2013 г .

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Строение и фотофизические характеристики псораленов Псоралены (фурокумарины) – соединения растительного или синтетического происхождения. Они образуются в результате линейной (псорален, 8-метоксипсорален, 5-метоксипсорален и др.) или угловой (ангелицин) конденсации двух гетероциклов: фуранового кольца и кумарина [15]. На рисунке 1 представлены химические структуры некоторых фурокумаринов .

–  –  –

Рисунок 1. Химические структуры псораленов .

Фурокумарины (ФК), применяемые в медицине в качестве фотосенсибилизаторов, поглощают свет в УФА области спектра (315-400 нм). Их максимумы поглощения лежат около 290-330 нм, причем положения максимумов практически не зависят от полярности растворителя [15]. При поглощении квантов света молекулы псораленов переходят в электронно-возбужденное состояние. Из них большая часть дезактивируется безызлучательно, а другая часть молекул из электронно-возбужденного синглетного состояния вступает в фотохимические реакции, флуоресцирует или переходит в триплетное состояние в процессе интеркомбинационной конверсии [40] .

Псоралены, как и другие фотосенсибилизаторы, вступают в фотоокислительные реакции из триплетного возбужденного состояния, время жизни в котором для них составляет 2-7 мкс [20], что значительно дольше, чем в синглетном состоянии (1-4 нс) [61]. Особенность ФК, как органических молекул, состоит в том, что триплетное состояние не делокализовано по всей системе сопряженных двойных связей, а локализуется в области 3,4-двойной связи [75]. Следовательно, в фотоокисленных реакциях участвует, в основном, 3,4-двойная связь .

1.2. Фотохимические реакции фурокумаринов

–  –  –

Показано, что ФК образуют циклобутановые аддукты между 3,4-двойной связью ФК и одной из двойных связей ненасыщенных жирных кислот. Эти аддукты приводят к повреждению антиоксидантой системы клетки, ингибированию активности фосфолипаз, препятствуют активации протеинкиназы С и других регуляторных ферментов клеток. Доказано, что аддукты ФК-ДНК обуславливают летальное и мутагенное действие ФК на бактерии, вирусы и опухолевые клетки [68] .

Реакции типов I, II и IV являются фотодинамическими, т.е. происходят с участием кислорода. Субстратами для фотодинамических реакций могут служить белки, липиды и ДНК [5]. В реакциях типа I образуются свободные радикалы в результате переноса электрона (или водорода) между молекулами ФК в возбужденном состоянии и молекулами субстрата. Кислород, взаимодействуя с радикалами, делает эти реакции необратимыми. Показано, что окисление липидов и -токоферола, индукция ПУВА-эритемы могут быть результатом реакций типа I [5] .

В реакциях второго типа триплетный псорален реагирует с молекулярным кислородом. Такие реакции могут сопровождаться образованием супероксидного радикала. Чаще образуется синглетный (IO2) кислород при переносе энергии с электронно-возбужденного триплетного состояния сенсибилизатора на молекулярный кислород. Но роль синглетного кислорода в индукции фотобиологических эффектов ФК не велика .

В реакциях IV типа с субстратом реагируют относительно стабильные фотоокисленные молекулы ФК [11] .

1.3. Мембранотоксические эффекты продуктов фотоокисления псоралена ПУФА-гемолиз В 1986 году, впервые, в нашей лаборатории было обнаружено, что псорален в сочетании с УФА способен вызывать деструкцию мембран .

Указанный факт был продемонстрирован на модели гемолиза – последний является хорошей моделью для оценки мембранотоксических свойств химических соединений (например, лекарств). Для этого в разбавленную суспензию эритроцитов добавляли псорален, и проводили УФА-облучение полученной смеси (ПУФА-гемолиз). Обязательным условием для возникновения такого гемолиза являлась последующая термоактивация указанного раствора до температуры 37оС. При этом известно, что гемолитический эффект для других ФК не зависит от такой термоактивации .

Отсюда возникло предположение, что за гемолитический эффект псоралена ответственными являются не первичные продукты облучения псоралена, а образующиеся в ходе темнового термовоздействия вторичные продукты деградации исследуемого фурокумарина. Кроме того, было показано, что характер индуцированного псораленом гемолиза зависит от интенсивности УФА-излучения [65]. В соответствии с этим было выделено два вида ПУФА-гемолиза: высокоинтенсивный (ВИ) и низкоинтенсивный (НИ) .

НИ ПУФА-гемолиз (интенсивность УФА-излучения ниже 80 Вт/м2) имеет черты коллоидно-осмотического гемолиза. Коллоидно-осмотический гемолиз сопровождается увеличением катионной проницаемости и увеличением объема клетки с последующим лизисом последней [63] .

Примером такого вида повреждения эритроцитов является гемолиз под действием коротковолнового УФ-излучения ( 320 нм) или более длинноволнового света в присутствие фотосенсибилизаторов [63]. Некоторые вещества, например, сахароза, при их добавлении в суспензионную среду, способны тормозить этот процесс: сахароза выравнивает осмотическое давление, препятствуя развитию коллоидно-осмотического гемолиза Для [67] .

фотогемолиза, протекающего по коллоидно-осмотическому механизму, характерным является тот факт, что после облучения лизису подвергаются все клетки суспензии, а кривая зависимости доли лизировавших клеток от времени постлучевой инкубации имеет сигмоидную форму .

Скоростью гемолиза принято называть отношение 1/t50, где t50 – время, за которое лизировало 50 % клеток в суспензии. Было показано, что скорость НИ ПУФА гемолиза описывается уравнением: v = vo+ aDx, где vo – скорость в присутствии сенсибилизатора, но без облучения; a – коэффициент, зависящий от вида и концентрации сенсибилизатора, спектрального состава света и концентрации клеток; D – доза облучения; х – безразмерный параметр, для НИ ПУФА равный приблизительно 2. На рисунке 3 представлена зависимость скорости гемолиза от дозы облучения .

Рисунок 3. Зависимость скорости ПУФА гемолиза от дозы облучения при низкой интенсивности УФА-излучения (366 нм, 20,5 Вт/м2) .

Кривая построена по результатам трех независимых экспериментов. Рисунок представлен согласно работе [3] .

Таким образом, НИ ПУФА-гемолиз обладал следующими свойствами коллоидно-осмотического гемолиза:

пороговая доза ПУФА-воздействия, ниже которой гемолиз не вызывается, отсутствует;

лизируют все клетки;

кривая гемолиза имеет сигмоидный характер;

скорость гемолиза пропорциональна квадрату дозы облучения;

гемолиз является термоактивируемым – развивается при температуре 37oС свыше (среди соединений фурокумаринового ряда последнее характерно только для псоралена);

образующиеся каналы непроницаемы для сахарозы .

При увеличении интенсивности действующего света характер гемолиза изменяется. ВИ ПУФА-гемолиз характеризуется следующими чертами, схожими с чертами гемолиза, при котором предполагается образование крупных каналов проницаемости, через которые может осуществляться утечка не только ионов, но и крупных молекул, например сахарозы и, возможно, гемоглобина. Этот механизм гемолиза эритроцитов характерен для детергентов. Отличительной чертой гемолиза, индуцированного добавлением детергентов к эритроцитам, является наличие пороговой концентрации детергента, ниже которой гемолиз не индуцируется. При дальнейшем увеличении концентрации детергента в суспензии лизирует только часть клеток, при этом долю лизировавших клеток называют амплитудой гемолиза. Зависимость амплитуды гемолиза от концентрации детергента носит сигмоидный характер и при высоких концентрациях детергента гемолиз становится завершенным, т.е. в суспензии наблюдается лизис 100% клеток. Аналогичное поведение гемолитической кривой было продемонстрировано в модели ВИ ПУФА-гемолиза (рисунок 4). Такой механизм гемолиза был назван механохимическим .

Таким образом, ВИ ПУФА-гемолиз обладал следующими свойствами механо-химического гемолиза:

существует пороговая доза облучения, ниже которой гемолиз не индуцируется;

в узком интервале малых доз облучения лизируют не все клетки суспензии, а только их часть;

Рисунок 4. Зависимость амплитуды (кривая 1) и скорости (кривые 2 и 3) ПУФАгемолиза от дозы облучения при различной интенсивности УФА-излучения: кривые 1 и 2 – 154 Вт/м2; кривая 3 – 20,5 Вт/м2 .

Представлены усредненные результаты 3 опытов ± SEM. Согласно работе [3] .

дозовая зависимость доли лизировавших клеток (амплитуды гемолиза) имеет сигмовидную форму;

не нуждается в обязательной термоактивации .

ФОП гемолиз Ранее, в нашей лаборатории было показано, что ФК способны вызывать гемолиз не только при совместном их облучении в суспензии эритроцитов (ПУВА-гемолиз), но и при добавлении предварительно облученного раствора псораленов в эритроцитарную суспензию (ФОП-гемолиз) [3]. Было обнаружено, что ФОП-гемолиз обладает чертами ВИ ПУФА-гемолиза, т.е .

протекает по механо-химическому типу. На рисунке 5 представлены дозовые зависимости амплитуды и скорости ФОП-гемолиза. Сходство ВИ ПУФА- и ФОП-гемолиза дало возможность предположить, что псоралениндуцируемый гемолиз может осуществляться через стадию образования его фотопродуктов .

Рисунок 5. Дозовые зависимости амплитуды и скорости ФОП-гемолиза .

ФОП получали УФА-облучением (365 нм, I = 180 Вт/м2) раствора псоралена (0,1 мМ, 1% этанола) в фосфатном буферном растворе (ФБР) (pH = 7,4) при t = 20оC. Амплитуду гемолиза определяли после смешивания ФОП с суспензией эритроцитов (20 млн.кл./мл) в соотношении 1:1 и последующей инкубации при t = 37оС. Согласно работе [3] .

В модели гемолиза индуцированного ионолом было обнаружено, что его гемолитический эффект начинает проявляться одновременно с агрегацией молекул последнего в ходе увеличения его концентрации. При этом существовала пороговая концентрация ионола, при которой не регистрировался ни гемолитический эффект, ни значимая его агрегация .

Таким образом, появляющиеся в растворе агрегаты ионола могли быть ответственными за деструкцию мембран эритроцитов .

Обнаружение агрегации ионола осуществлялось спектрофотометрическим методом по D светорассеяния при 290 нм. Выбор этой длины волны обусловлен следующим: обычно регистрацию светорассеяния производят вне полосы поглощения; при этом наименьшая длина волны, которую можно использовать для ионола где нет поглощения составляет 290 нм (далее начинается полоса поглощения указанного соединения). Известно, что псорален поглощает до 400 нм, поэтому чтобы обнаружить агрегаты псоралена по величине D светорассеяния необходимо проводить измерения при 400 нм и больших длинах волн. Агрегаты псоралена имеют малый размер, а указанное светорассеяние является рэлеевским. Для такого типа светорассеяния интенсивность светорассеяния обратно пропорциональна длине волны в четвертой степени. Поэтому с помощью метода регистрации светорассеяния по типу рэлеевского обнаружить агрегацию псоралена не удалось .

Также было обнаружено, что последующее увеличение концентрации ионола приводило к снижению его гемолитической эффективности. Авторы предположили, что постепенное увеличение размеров агрегатов в ходе повышения концентрации ионола приводит к ухудшению их гемолитических свойств .

Сходное с ионолом поведение гемолитической кривой было обнаружено и для ФОП-гемолиза, а именно: увеличение дозы облучения псоралена приводило в конечном итоге к снижению гемолитической эффективности последнего. Проведя аналогию с механизмом гемолиза, индуцированного ионолом, авторы предположили, что за деструкцию мембран эритроцитов в случае ФОП-гемолиза могли быть ответственны образующиеся агрегаты продуктов фотоокисления псоралена. При этом ухудшение гемолитических свойств ФОП с увеличением дозы облучения могло быть также следствием увеличения размеров агрегатов продуктов ФОП. Однако, как уже было сказано выше, обнаружить такие агрегаты авторам не удалось, т.к. для этого не было подходящих методов. Регистрация таких агрегатов в растворе ФОП могла бы позволить сделать более уверенное предположение о роли агрегатов в механизме ФОП–гемолиза .

В настоящее время существует метод резонансного светорассеяния, позволяющий селективно и чувствительно обнаруживать агрегаты красителей. В следующем разделе подробно рассматривается этот метод .

1.4. Общие положения теории РСР .

Согласно данным литературы, метод резонансного светорассеяния является одним из самых чувствительных и селективных для регистрации агрегации фотосенсибилизаторов [87] .

Обычно эксперименты по регистрации светорассеяния проводят в спектральной области, где нет поглощения света исследуемыми молекулами .

Явление усиления светорассеяния в области поглощения молекул получило название резонансного светорассеяния (РСР). Интенсивность рассеянного света при агрегации хромофоров может возрастать на несколько порядков в области полос поглощения, обусловленных -электронными переходами .

Классические и квантово-механические расчеты эффектов резонансного рассеяния на некоторых формах агрегатов даны в работах [59; 60] .

Когда свет проходит через раствор агрегатов (в непоглощающем растворителе), энергия проходящего пучка уменьшается за счет двух процессов: поглощения и рассеяния на агрегатах. Возникновение рассеянного света есть следствие различий поляризуемости агрегатов и растворителя. Падающая электромагнитная волна индуцирует осциллирующий диполь в агрегате, который излучает свет в разных направлениях. Отношение скорости поглощения энергии из падающего пучка к интенсивности падающего пучка называется поперечным сечением поглощения (абсорбции) – Сabs. Отношение скорости рассеяния (во всех направлениях) к интенсивности падающего пучка называют поперечным сечением рассеяния – Сsca.

Если индуцированный диполь можно считать точечным (размеры агрегата малы по сравнению с длиной волны падающего света), оба поперечных сечения связаны с поляризуемостью агрегатов простым способом:

,, где k – волновой вектор и равен 2/, а – поляризуемость агрегатов,

– длина волны .

Поглощение зависит от первой степени поляризуемости, которая, в свою очередь, линейно связана с объемом агрегата. Напротив, степень рассеяния зависит от квадрата объема агрегатов и поэтому оно резко увеличивается в результате агрегации. Следовательно, РСР очень чувствительный метод для обнаружения даже малых концентраций крупных агрегатов .

Спектры РСР измеряют на спектрофлуориметрах с двумя монохроматорами, настроенными на одну и ту же длину волны. Однако измеренные спектры РСР бывают искажены как регистрирующим прибором, так и самим объектом исследования .

В этой связи в настоящей работе для получения исправленных спектров РСР использовались поправки, представленные в работе [91]:

Поправка на эффекты внутреннего светофильтра:

1) При прохождении возбуждающего света через кювету до задних слоев доходит меньше света, чем до передних. За счет такого экранирования задних слоев передними происходит ослабление регистрируемого сигнала светорассеяния. Рассеянный свет имеет ту же длину волны, что и падающий, поэтому, проходя через толщу образца, он будет реабсорбироваться, что еще дополнительно уменьшит интенсивность регистрируемого рассеянного света .

Эти два эффекта (экранировки и реабсорбции) и есть эффекты внутреннего фильтра .

Для исправления сигнала РСР на эффекты внутреннего фильтра нами была использована следующая формула:

Iвнутр.фильтра=Iизм/10-D,

где D – оптическая плотность исследуемого образца при выбранной длине волны, – измеренный сигнал РСР;

Поправка на чувствительность прибора:

2) Для корректного введения поправки на чувствительность прибора в нашей лаборатории в качестве светорассеивающего эталона использовали водный раствор 0,125% додецил сульфата натрия (NaДДС). Поправочный коэффициент K() на спектральную чувствительность прибора получали разделив измеренную на флуориметре при каждой длине волны интенсивность светорассеяния раствора NaДДС (IДДС) на его оптическую плотность светорассеяния при тех же длинах волн (DДДС):

K()=IДДС()/DДДС() .

Конечная формула для исправления спектров РСР выглядела следующим образом:

.

При получении исправленных спектров РСР сначала из измеренного спектра РСР образца [Iизм()], исправленного на эффекты внутреннего фильтра, вычитают измеренную интенсивность рассеяния растворителя [Iраств()], затем полученную разность делили на коэффициент спектральной чувствительности .

1.5. Закон Бунзена-Роско .

Закон Бунзена-Роско, или закон взаимозаменяемости – один из основных законов фотохимии, открытый Р. Бунзеном и Г. Роско в 1862 году .

Согласно этому закону количество продукта фотохимической реакции определяется общим количеством энергии излучения, падающего на фотохимическую систему, т. е. произведением интенсивности излучения I на время действия облучения t (дозой облучения). Закон взаимозаменяемости наблюдается в тех случаях, когда первичная фотохимическая реакция не сопровождается вторичными реакциями других типов, и не осложнена ингибирующим действием сопутствующих веществ, в том числе и самими продуктами реакции. Тем не менее, необходимо отметить, что в сложных биологических системах, иногда наблюдается отклонение от выполнения указанного закона [70]. Так в работе [46] проверялось действие закона на моделях ФОП-гемолиза и ФОП-индуцированной супрессии реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) и было показано, что закон не выполняется в обоих случаях. Примечательно, что закон взаимозаменяемости для вышеуказанных биологических моделей (гемолиза и ГЗТ-иммуносупрессии) не выполняется в разные стороны. Увеличение интенсивности действующего на раствор псоралена света приводит к усилению его гемолитических свойств, одновременно снижая эффективность его иммуносупрессорного действия. При этом было показано, что при низкой интенсивности (менее 20 Вт/м2) ФОП-гемолиз не индуцировался даже при очень больших дозах облучения .

Другим примером невыполнения закона взаимозаменяемости является ПУФА-гемолиз (см. раздел 1.3). Было показано, что УФА-облучение эритроцитарной суспензии в присутствии псоралена низкими и высокими интенсивностями действующего света в одинаковых дозах приводит к разному проявлению гемолитической свойств ПУФА (ВИ ПУФА и НИ ПУФА, см. раздел 1.3) В разделе 3.2.7 настоящей работы приводятся результаты проверки выполнимости указанного закона взаимозаменяемости как на образование ФОП-агрегатов, так и апоптотического эффекта индуцированного продуктами фотоокисления псоралена .

1.6 Современные представления о механизмах развития реакции контактной чувствительности Реакция КЧ является самой часто используемой экспериментальной моделью аллергического контактного дерматита (АКД) у животных [62] .

Данное заболевание относится к реакциям замедленного типа и включает в себя две фазы – сенсибилизации (афферентная) и разрешения (эфферентная) .

Реакция КЧ у животных проявляется в виде воспаления и отека в месте повторного попадания в организм антигена. К настоящему времени, новые иммунологические и клеточные методы позволили значительно расширить представление об иммунных механизмах реакции контактной чувствительности. Например, были выявлены роли регуляторных Т-клеток, CD4 Тh17 и лангерин-положительных дендритных клеток (CD207+/CD103+), а также механизмы инициации и окончания реакции КЧ. Роль тучных клеток, долго остававшаяся предметом дискуссии, а также участие системы врожденного иммунитета (Толл- и NOD-подобных рецепторов) в настоящий момент представляется более понятной. В настоящей главе коротко описываются обе фазы развития реакции КЧ основываясь на классическом ее представлении, а также затронув последние достижения в данной области .

Фаза сенсибилизации Гаптены и барьерная функция кожи Стадия сенсибилизации реакции КЧ (рисунок 6) развивается после первичного контакта организма с антигеном. Контактная чувствительность инициируется в результате контакта кожи с высокореактивными химическими соединениями – гаптенами. Большинство гаптенов, вызывающих КЧ, являются липофильными химическими соединениями, с молекулярной массой обычно не превышающей 1000 Да, что позволяет им легко проникать в кожу животного или человека. Сами по себе гаптены не обладают антигенными свойствами, но, проникая в эпидермис и присоединяясь (чаще всего ковалентно) к собственным белкам организма и формируя гаптен-белковый комплекс [48], они приобретают антигенную активность [71]. При постановке реакции КЧ в роли гаптенов чаще всего выступают такие соединения как ДНФБ, тринитрохлорбензол (ТНХБ) и флуоресцеинизотиоционат (ФИТЦ), т.к. такие гаптены способны вызывать иммунный ответ как у человека, так и у мышей .

Тем не менее, известно, что не каждый гаптен способен индуцировать реакцию КЧ. Существование барьерной функции кожи предотвращает попадание аллергенов в тело человека или животного. Первой линией защиты является ее роговой слой – самый наружный слой эпидермиса, при этом эпидермальный белок филагрин играет здесь главную роль. Было показано, что дефекты гена, кодирующего филагрин, приводят к резкому повышению чувствительности мышей к гаптенам [55] .

Наличие тесного контакта интегральных белков (клаудинов и окклудинов) плазматической мембраны зернистого слоя эпителия является второй линией защиты, предотвращая проникновение в более глубокие слои кожи белковых антигенов. Тем не менее, как уже было указано, гаптены обычно настолько малы, что могут беспрепятственно проникать через такие плотные связи и в дальнейшем взаимодействовать с дендритными клетками кожи (ДК) [41] .

Роль дендритных клеток кожи в сенсибилизации АГ После захвата образовавшегося гаптен-белкового комплекса АПК, происходит его процессинг, и представление на ее поверхности вместе с молекулами главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I или II (рисунок 6) .

Известно, что в реакции КЧ в роли АПК выступают дендритные клетки кожи. До недавнего времени такая субпопуляция ДК как клетки Лангерганса (КЛ) считалась главными АПК во время фазы сенсибилизации, т.к. in vitro они обладают свойством представления АГ, присутствуют в коже в большом количестве и их повреждение с помощью антибиотика глиотоксина приводит к супрессии реакции КЧ [54]. При этом было показано, что ключевую роль в процессе сенсибилизации могут играть лангерин-положительные ДК CD207+/CD103+ (по другому обозначаемые как дермальные ДК, дДК), а не клетки Лангерганса (КЛ) [82]. Предполагается, что вышеуказанные субпопуляции ДК сотрудничают друг с другом по компенсаторному механизму, и при отсутствии одной из субпопуляций другая берет на себя ответственность за представление АГ [24] .

Кроме того, также было показано, что КЛ выполняют больше регуляторную, нежели стимулирующую роль во время афферентной фазы реакции КЧ: отсутствие данных клеток у мышей вызывало стимуляцию КЧ .

Продукция КЛ такого противовоспалительного цитокина как ИЛ-10 свидетельствует об их супрессорной функции в развитии данной реакции [38]. Наоборот, лангерин-положительные ДК стимулируют развитие афферентной фазы – их деплеция перед сенсибилизацией у мышей ингибирует реакцию КЧ [37]. Забегая вперед, отметим, что во время эфферентной фазы предполагается, что ДК выполняют регуляторную функцию, т.к. было показано, что их деплеция у сенсибилизированной мыши вызывает стимуляцию реакции КЧ [30] .

Активация системы врожденного иммунитета (доиммунных механизмов резистентности) Как уже было отмечено, полная активация ДК очень существенна для развития сенсибилизации. Тем не менее, многие механизмы активации гаптенами ДК остаются неясными. Влияние системы врожденного иммунитета на гаптен-индуцированную активацию ДК было продемонстрировано Martin et al. Активация врожденного иммунитета обеспечивается через Толл- и NOD-подобные рецепторы. В активации ДК гаптенами задействованы оба типа таких рецепторов. При использовании оксазолона, ФИТЦ или ТНХБ в качестве гаптена среди Толл-подобных (TLR) рецепторов, ответственных за созревание ДК, основными являются TLR-2 и TLR-4 [53]. Предполагается, что лигандами для этих рецепторов служат продукты деградации внеклеточного матрикса, образующиеся посредством реактивных форм кислорода, продукцию которых в свою очередь индуцируют вышеуказанные гаптены. При сенсибилизации никелем, рецепторами активации ДК у человека считаются TLR4 [72]. Контакт АПК с АГ (точнее – с гаптен-белковым комплексом) индуцирует переход АПК из состояния покоя в состояние активации .

Рисунок 6. Фаза сенсибилизации реакции КЧ .

Шаг 1: Гаптены активируют кератиноциты и тучные клетки посредством доиммунных механизмов резистентсноти (систем врожденного иммунитета). Активированные кератиноциты и тучные клетки синтезируют различные химические медиаторы, активирующие в свою очередь дендритные клетки кожи. Шаг 2: Активированные дендритные клетки захватывая антигены, начинают созревать и мигрировать в регионарные лимфатические узлы через их афферентные сосуды. Шаг 3: мигрировавшие дендритные клетки представляют АГ наивным Т-клеткам в ЛУ; происходит дифференцировка Т-клеток в АГ-специфические клетки памяти. Т-регуляторные клетки при этом нарушают взаимодействие между АПК и Т-клетками .

ЛУ – регионарные лимфатические узлы; нТ-клетки – наивные Т-лимфоциты; Т-рег – регуляторные лимфоциты CD4+25+; дДК – дермальные дендритные клетки кожи; ДК – дендритные клетки; TLR2/4 –Т-лимфоцитарные (клеточные) рецепторы 2/4; КЦ – кератиноциты; Схема представлена согласно работе [36] .

У активированных АПК индуцируется продукция цитокинов (ИЛ-1/, ИЛ-6, ИЛ-12, хемокинов), усиливается экспрессия адгезионных и костимуляторных молекул, молекул МНС [57; 76]. Другие цитокины, такие как фактор некроза опухоли (ФНО-), гранулоцитарно-макрофагальный колоние-стимулирующий фактор (ГМ-КСФ) могут также вызывать активацию АПК [17] .

Те гаптены, которые не были фагоцитированы АПК, активируют кератиноциты через NOD-подобные рецепторы, которые синтезируют в ответ различные химические медиаторы, такие как ФНО-а, ИЛ-1 и простагландин-Е2. Последние, в свою очередь, запускают миграцию и созревание дендритных клеток [39] .

Таким образом, система врожденного иммунитета ответственна за активацию гаптенами АГ-представляющих клеток кожи, определяя в итоге аллергический потенциал каждого гаптена. Во время эфферентной фазы реакции КЧ посредством такого АГ-неспецифического механизма происходит активация эндотелиальных клеток кожи .

Роль тучных клеток в развитии реакции КЧ Хотя известно, что тучные клетки обладают способностью захватывать и представлять АГ, возможность их служить как АПК в реакции КЧ представляется сомнительной [58]. Тем не менее, было показано, что дефицит данных клеток вызывал супрессию реакции КЧ у ТНХБсенсибилизированных мышей по сравнению с контролем [12]. В 2011 году двумя группами исследователей, независимо друг от друга, была предложена эффективная система абляции тучных клеток с помощью введения дифтерийного токсина. Обе группы исследователей показали, что деплеция тучных клеток у мышей оборачивается подавлением реакции КЧ (индуцированной ФИТЦ или оксазолоном), а именно: снижением миграции и созревания ДК, а также Т-клеточного прайминга на афферентой фазе [23; 58] .

Предполагается, что взаимодействие между тучными и дендритными клетками приводит к их обоюдной активации. Т.к. тучные клетки являются основными депо гистамина, их дефицит на эфферентной фазе приводит к супрессии последней, возможно, из-за уменьшения сосудистой проницаемости, вызванной малой концентрацией данного медиатора [23] .

Представление АГ дендритными клетками Т-лимфоцитам, дифференцировка эффекторных клеток АГ-презентирующие ДК, активированные и захватившие АГ, мигрируют к афферентным лимфатическим сосудам и переносятся в регионарные лимфатические узлы, где представляют АГ наивным Т-клеткам:

в комплексе с молекулами МНС класса I – предшественникам цитотоксических лимфоцитов (CD8+); в комплексе с молекулами МНС класса II – предшественникам Т-хелперов (CD4+) [47; 84]. Контакт между наивными Т-клетками и ДК обеспечивается с помощью молекул адгезии ICAM-1/2 и DC-SIGN со стороны ДК, а со стороны Т-лимфоцитов – LFA-2/3 и ICAM-3 соответственно. Т-лимфоциты после презентации им антигена активируются [56] .

Было показано, что в процессе взаимодействия ДК и Т-лимфоцитов в регионарных ЛУ принимают участие и Т-регуляторные лимфоциты [36]. Механизмы такого вмешательства Т-рег во CD4+CD25+ взаимоотношения ДК и нТ-лимфоцитов в настоящий момент полностью не раскрыты. Тем не менее, известно, что CD4+CD25+ способны блокировать прайминг, активацию и пролиферацию CD8+-эффекторных Т-лимфоцитов .

Возможным объяснением супрессорной роли CD4+CD25+ может быть их способность вызывать апоптоз CD8+-эффекторов через FasL-зависимый механизм, а также ингибировать секрецию ИЛ-2 АПК, необходимого для Тклеточной пролиферации [18] .

Активированные Т-лимфоциты начинают секретировать множество различных цитокинов, основным среди которых является ИЛ-2, вызывающий пролиферацию Т-клеток. В результате этого процесса образуется пул зрелых АГ-специфических эффекторных клеток CD8+ и CD4+ Т-клеток памяти, которые выходят в кровоток и распространяются по тканям, попадая в том числе и в кожу [47; 84] .

Необходимо отметить, что типы цитокинов, синтезируемых АПК, определяют дальнейшую судьбу дифференцировки CD4+ и CD8+ на субпопуляции Th1/Tc1 или Th2/Tc2 соответственно. Поэтому, синтезируемые АПК цитокины называют «поляризующими» [18]. В свою очередь, какие поляризующие цитокины будут преобладать во время процесса такой дифференцировки зависит от конкретного гаптена. Известно, что ДНХБ и ДНФБ индуцируют синтез АПК ИЛ-12, который ведет к образованию (дифференцировке) Т-субпопуляций «типа 1» - Th1/Tc1. Если в качестве гаптена выступает ФИТЦ – Т-лимфоциты дифференцируются во 2-ой субпопуляционный тип - Th2/Tc2. Кроме уже упомянутых двух типов субпопуляций, наивные Т-клетки (Th0/Тс0) в присутствии ТФР- (TGF-), ИЛ-6 и ИЛ21 могут трансформироваться в Th17/Тс17-субпопуляции, продуцирующие ИЛ-17 [18]. ИЛ-17 является провоспалительным цитокином, обеспечивающий инфильтрацию тканей лимфоцитами. Было показано, что после повторной аппликации гаптена (фаза разрешения, рисунок 7) Тс17клетки привлекаются на место пораженного участка кожи первыми и играют главную роль в процессе инициации иммунного ответа в реакции КЧ [34] .

Представленные в литературе сведения, касающиеся фенотипа клеток, являющихся эффекторами КЧ или ингибиторами данной реакции, весьма противоречивы. Было показано, что функции эффекторных клеток КЧ могут выполнять разные клетки, а именно, CD8+ цитотоксические Т-лимфоциты первого типа [80], /CD8+-Т-клетки [31]. Как уже было сказано, предполагается, что фенотип индуцированных клеток-эффекторов КЧ зависит, прежде всего, от типа гаптена, а так же от генетических особенностей организма [36]. Тем не менее большинство исследований на мышах показывают, что сенсибилизация животных, например, ДНФБ, приводит к генерации эффекторных Т-клеток КЧ, имеющих преимущественно фенотип клеток CD8+ Tcl, тогда как CD4+ Th2 лимфоциты выполняют роль регуляторных клеток [18] .

Эффекторная стадия

Фаза разрешения КЧ (рисунок 7) начинается при повторном контакте антигена с организмом (накожная аппликация АГ, либо внутри- или подкожные инъекции АГ) .

Данную фазу обычно подразделяют на две части: раннюю – происходящую в течение первых двух часов и позднюю – спустя 24 часа после повторного нанесения гаптена. Первая фаза по сути представляет из себя АГнеспецифическое (иначе – доиммунное [6]) воспаление, которая затем влечет за собой вторую фазу АГ-специфического воспаления .

В течение двух часов после нанесения гаптена на кожу сенсибилизированного животного происходит активация кератиноцитов, которые, продуцируя ИЛ-1 и ФНО- посредством NOD-зависимого механизма (см. выше), в свою очередь заставляют клетки эндотелия экспрессировать молекулы адгезии (ICAM-1 и P/E-селектины) [36]. Такие молекулы адгезии обеспечивают миграцию Т-клеток памяти из кровотока в место воспаления. Кроме того, в развитии доимунного воспаления принимают участие нейтрофилы, чью миграцию в ткани обеспечивает выброс гистамина тучными клетками [36] .

Во второй фазе АГ представляется эффекторным Т-лимфоцитам клетками Лангерганса и дДК, хотя АГ-специфические лимфоциты могут сами распознавать сходный АГ [71]. В результате узнавания антигена, активированные АГ-специфические Т-эффекторные клетки продуцируют ИФН-, ФНО- (Th1/Tc1) и ИЛ-17 (Th17/Tc17). Данные цитокины стимулируют кератиноциты, вызывая продукцию ими провоспалительных цитокинов ИЛ-1 и ИЛ-6. Продуцируемые Т-лимфоцитами цитокины активируют клетки, обладающие киллерной активностью (макрофаги, натуральные киллеры, цитотоксические лимфоциты). Секретируемые лимфоцитами фактор ингибирующий миграцию макрофагов и фактор хемотаксиса макрофагов стимулируют хемотаксис клеток моноцитарномакрофагального ряда (макрофагов, полиморфноядерных клеток) непосредственно в очаг реакции .

Рисунок 7. Эфферентная фаза реакции КЧ .

Шаг 1: повторная аппликация гаптена приводит к активации кератиноцитов и тучных клеток, в ответ синтезирующие различные химические медиаторы, которые в свою очередь активируют клетки эндотелия и вызывают инфильтрацию кожи клетками воспаления, в том числе АГ-специфическими Тклетками. Шаг 2: дендритные клетки активируют АГ-специфические Т-клетки, которые синтезируют цитокины ИЛ17 и ИФН- в свою очередь активируя кератиноциты и вызываю дальнейшую клеточную инфильтрацию кожи. Шаг 3: Т-регуляторные клетки возвращаются обратно в регионарные ЛУ, тем самым нарушая дальнейшую дифференцировку АГ-специфических клеток. ЛУ – регионарные лимфатические узлы; Трег – регуляторные лимфоциты CD4+25+; дДК – дермальные дендритные клетки кожи;

КЦ – кератиноциты; Схема представлена согласно работе [36] .

В результате выброса Т-лимфоцитами, макрофагами и полиморфоядерными клетками провоспалительных цитокинов происходит дегрануляция тучных клеток, выброс гистамина и вазодилатация. Запуск вышеописанных эффекторных механизмов приводит к локальному неспецифическому воспалению – отеку и разрушению ткани в месте повторного попадания АГ, а также инфильтрации ее мононуклеарными клетками [71] .

Через 24-48 часов после повторного нанесения гаптена, в место воспаления мигрируют Т-регуляторные (CD4+CD25+) и В-клетки (СD19+). Механизм такой миграции на сегодняшний день остается неизвестным. Синтезируемый данными клетками цитокин ИЛ-10 оказывает противовоспалительный эффект. Кроме того CD4+CD25+ нарушают процесс представления АГ эффекторным Т-клеткам [36]. Таким образом основными клетками, отвечающими за разрешение (терминацию) реакции на сегодняшний день считают CD4+CD25+ T-лимфоциты [18; 36] .

Реакция КЧ отличается от других видов гиперчувствительности тем, что она может быть перенесена Т-клетками лимфатических узлов и селезенок от сенсибилизированных гаптеном животных к интактным сингенным, т.е .

генетически идентичным, животным. Такой перенос реакции КЧ называется адоптивным переносом [79]. Метод адоптивного переноса широко используется при изучении механизмов развития реакции КЧ, а также при изучении иммунных механизмов влияния различных факторов, включая ПУВА-терапию и фотоферез на КЧ [52] .

1.7 Иммунологические эффекты ПУВА-терапии и фотофереза .

Проведение ПУВА-терапии заключается в пероральном или местном введении фурокумаринов с последующим облучением пораженного участка кожи УФА-светом [14]. Данный вид лечения применяется в лечении ряда кожных заболеваний, обусловленных гиперреактивностью Т-клеточного звена иммунной системы – контактного или атопического дерматитов, витилиго и псориаза. Предполагается, что лечебное действие ПУВА-терапии основано на индукции супрессии Т-клеточного иммунного ответа in vivo [51] .

Эти данные были получены как в модельных системах Т-клеточного иммунного ответа in vivo на животных (реакция гиперчувствительности замедленного типа или контактной чувствительности), так и путем лабораторного анализа иммунного статуса больных, проходящих ПУВАтерапию. Так, на модели АКД – реакции КЧ было показано, что первичной мишенью при ПУВА-терапии на ее афферентной стадии являются клетки Лангерганса: проведение ПУВА нарушает их свойства представлять АГ Тклеткам регионарных лимфатических узлов [9]. Кроме того, во время проведения ПУВА-терапии происходит снижение пролиферации кератиноцитов [49]. Как в мышиной модели псориаза, так и путем цитофлуориметрического анализа периферической крови больных было показано, что ПУВА-терапия восстанавливает нарушенный при данной нозологии баланс Th17/T-регуляторных клеток, функцию СD4+/CD25+клеток, а также увеличивает их количество в коже по окончанию данной процедуры [26; 78] .

Процедура экстракорпорального фотофереза (ЭКФ) заключается в выделении мононуклеаров (агранулоцитов) крови человека, их облучении УФА-светом в присутствии псораленов (чаще всего 8-МОП) и последующей реинфузии в кровоток [26]. Основными показаниями для проведения данной процедуры является наличие Т-опосредованных онкологических/аутоиммунных заболеваний, таких как кожная Т-клеточная лимфома, псориаз, РТПХ, склеродермия и других [86] .

В последнее время в литературе все больше уделяется внимание апоптозу как важному механизму терапевтического действия фотофереза [14]. Однако предполагается, что лечебный эффект фотофереза не заключается в непосредственной индукции гибели клеток, ответственных за патогенез вышеуказанных нозологий. Так было показано, что при процедуре фотофереза у больных кожной Т-клеточной лимфомой селективная деплеция опухолевых клеток (т.е. по сути, временное снижение их концентрации в кровотоке) не может объяснить успешное терапевтическое действие настоящей процедуры. Наоборот, достигнутое понимание механизмов взаимодействия между клетками вошедшими в апоптоз (а точнее, апоптотическими тельцами) и АГ-представляющими дендритными клетками позволяет предположить один из механизмов действия ЭКФ [81] .

При каждом сеансе ЭКФ, УФА-облучение лейкоцитарной массы в присутствии 8-МОП может индуцировать апоптоз более чем 60% клеток (приблизительно 5 млрд. клеток на процедуру) в течение 24-48 часов. При этом большинство клеток после реинфузии удерживаются в селезенке и печени, где они захватываются незрелыми дендритными клетками. После фагоцитоза дендритными клетками апоптотических клеток и телец эти клетки становятся иммунологически толерантными, вместо того, чтобы приобретать фенотип зрелых АПК – экспрессировать костимуляторные молекулы CD80, CD86 и CD 83, а также MHC-II и ФНО- .

В литературе было показано, что такие иммунотолерантные ДК в большом количестве образуются после проведения ЭКФ у больных РТПХ. В мышиных моделях РТПХ и реакции КЧ также обнаружено, что ЭКФ вызывает снижение продукции ДК таких провоспалительных цитокинов как ФНО-, ИЛ-1, ИЛ-12 и наоборот, увеличивает синтез ИЛ-10. При этом известно, что последний является ключевым цитокином в подавлении Th-1 иммунного ответа и одновременно, как и ФНО- ответственен за развитие «индуцированных» Т-регуляторных клеток. Действительно, в работе [73] было показано, что после процедуры фотофереза происходит увеличение содержания Т-регуляторных клеток в кровотоке и их продукции цАМФ. Роль последнего заключается, в том числе, в снижении синтеза провоспалительных цитокинов ИЛ-2 и ИФН-лимфоцитами [73] .

Необходимо отметить, что под действием ЭКФ происходит и апоптоз моноцитов. Тем не менее, обнаружено, что выжившие клетки сохраняют все свои свойства, включая представление АГ и последующую дифференцировку в ДК. Последнее может говорить о том, что сам по себе апоптоз моноцитов оборачивается только снижением их концентрации в кровотоке, и тем самым не может являться главным механизмом иммуносупрессорного действия фотофереза [33]. Суммируя приведенные выше результаты исследований можно заключить, что триггером иммуносупрессорного, и, соответственно, терапевтического действия ЭКФ может служить апоптоз Т-лимфоцитов. В дальнейшем фагоцитоз апоптотических телец дендритными клетками нарушает созревание последних, меняет их цитокиновый профиль .

Вследствие этого нарушается процесс представления антигена дендритными клетками Т-лимфоцитам, дифференцировка последних в клетки-эффекторы, а также их дальнейшая пролиферация [81]. Кроме этого, модуляция цитокинового баланса ДК ведет к развитию и пролиферации Т-регуляторных клеток, в свою очередь обладающих различными супрессорными свойствами .

Так например известно, что CD4+25+-лимфоциты препятствуют процессу представления антигена ДК Т-лимфоцитам. В реакции КЧ было показано, что перенос таких ЭКФ-индуцированных Т-регуляторных клеток сингенным мышам-реципиентам вызывал АГ-специфическую иммунотолерантность последних [52]. Исходя из вышеизложенного ясно, что на сегодняшний день апоптоз действительно может являться важнейшим, хотя и опосредованным механизмом иммуносупрессорного действия ПУВА-воздействия. Также было показано, что в основе иммуносупрессорного эффекта фотофереза может лежать нарушение процесса формирования клона АГ-специфических Тлимфоцитов [35] и угнетение пролиферации Т-активированных клеток [52;

88], а также изменение профиля секретируемых ими цитокинов [51]. Так в работах [25; 52] было показано, что действие комбинации 8-МОП и УФАсвета на лимфоциты крови снижает продукцию ИФН- ИЛ-2 и ИЛ4 СD4+ Th1-клетками .

Ранее было продемонстрировано супрессорное действие фотофереза на реакцию КЧ. Согласно данным Maeda et al. фотоферез ингибирует как афферентную, так и эффекторную стадии реакции КЧ [25; 52]. В литературе уделяется значительное внимание индукции Т-регуляторных клеток в модуляции Т-клеточного иммунного ответа при данном воздействии [51] .

Предполагается, что подавление КЧ при действии фотофереза на афферентной стадии связано с индукцией Т-регуляторных клеток, тогда как подавление эффекторной стадии КЧ обусловлено стимуляцией продукции противовоспалительного цитокина ИЛ-10 [52] .

1.8 Методы регистрации апоптоза Как было упомянуто в разделе 1.6, одним из иммунных механизмов супрессорного действия фотофереза может быть индукция апоптоза АГспецифических Т-клеток [81]. Также было показано, что обработка ФОП in vitro культур опухолевых клеток стимулирует их апоптоз [16]. В этой связи представляется интересным рассмотреть механизмы индукции апоптоза и методы его регистрации .

Апоптоз – запрограммированная гибель клетки в ответ на внешние или внутренние сигналы. Элиминируются клетки выполнившие свою функцию, потенциально опасные для организма. Это происходит, например, во время эмбриогенеза, эндокринзависимой атрофии тканей (в т.ч. во время позитивной и негативной селекции тимоцитов), в процессе удаления стареющих клеток [7] .

Обычно выделяют два основных пути апоптоза по характеру запуска этого процесса: 1) рецепторный, когда сигналы к запуску апоптоза поступают извне и опосредованы через специальные рецепторы; 2) нерецепторный апоптоз – сигнал к апоптозу находится внутри самой клетки .

Важнейшими рецепторами апоптоза принято считать TNFR и FasR (или CD95), последний экспрессируется практически на всех клетках организма, особенно при их активации. Лигандом этого рецептора является FasL, который экспрессируют в основном активированные CD8+,CD4+ и NKлимфоциты [89] .

Взаимодействие FasR и FasL приводит к образованию «смертьиндуцирующего сигнального комплекса» (DISC – death-inducing signaling complex), который активирует каскад внутриклеточных специфических цистеиновых протеаз – инициирующих каспаз. Они, в свою очередь, запускают эффекторные каспазы, которые осуществляют протеолиз более 70ти жизненно важных для клетки белковых субстратов. В итоге активируются каспаз-зависимые эндонуклеазы, которые приводят к деградации ДНК до олигонуклеосомных фрагментов, происходит формирование «апоптозных телец» (которые потом элиминируются фагоцитозом) [7]. Однако стоит отметить, что экспрессия Fas-рецептора клеткой происходит при её активации в любом случае, что как раз и говорит о запрограммированной её гибели – рано или поздно. Логичным представляется тот факт, что клетки памяти таковых рецепторов не имеют [92] .

Сигналами к запуску нерецепторного апоптоза являются: изменение «оксидантного статуса» клетки, нарушение процессов активации клетки, активация мембранных стресс-киназ, нарушение митотического цикла. Все эти факторы могут приводить к нарушению баланса между анти- (BCL-2) и проапоптогенными (BAX) белками в сторону последних, что ведет к падению трансмембранного потенциала, образованию пор в митохондриальной мембране и выходу цитохрома-С в цитоплазму [92] .

Цитохром-С образует комплекс с белком Apaf1, который инициирует запуск каспаз-реакций, что и приводит в конечном счете к апоптозу [90] .

Среди многочисленных способов оценки апоптоза ниже будут рассмотрены два метода проточной цитофлюориметрии, использованных в настоящей работе:

1) метод с флуорохромом пропидием иодида (PI) и 2) совместного использования йодистого пропидия с Аннексином-V, меченного ФИТЦ .

Метод 1. Использование детергента Тритона-X100 как одного из компонентов красящего раствора позволяет PI проникать внутрь клеток .

Далее происходит его интеркаляция между спиралями ДНК, причем связывание это – стехиометрическое, т.е. количество молекул связавшегося красителя строго пропорционально количеству ДНК в клетке. Обработка апоптотирующих клеток преципитирующими фиксаторами (например, 70%ым этанолом) и последующее отмывание клеток приводит к потере клетками низкомолекулярных фрагментов ДНК. При окрашивании ДНКфлуорохромами такие клетки будут окрашиваться слабее, нежели нефиксированные клетки, что будет приводить к снижению их флуоресценции [7] .

Рисунок 8. Схематичное изображение гистограммы флуоресценции, получаемой при цитофлуорометрическом анализе клеток, окрашенных ДНК-флуорохромом .

Рисунок представлен согласно работе [7] .

На рисунке 8 приведена типичная гистограмма, получаемая при окрашивании ДНК йодистым пропидием. G0, G1, S, M – фазы жизненного цикла клетки .

Покоящиеся клетки (G0) и клетки, находящиеся в пресинтетической фазе клеточного цикла (G1), содержат количество ДНК, соответствующее диплоидному набору хромосом (2N); на гистограмме это отражается в виде так называемого диплоидного (G0+G1) пика. В премитотической фазе (G2) и фазе митоза (М) число хромосом и содержание ДНК удваивается (4N), что отражается в виде G2 + М-пика. В фазе синтеза (S) содержание ДНК колеблется от 2N до 4N. Содержание ДНК в сравнении с клетками, находящимися в фазах клеточного циклах, в G0G1 апоптотирующих клетках после соответствующей обработки (преципитирующие фиксаторы, отмывание) снижается, что выражается в появлении на гистограммах так называемого гиподиплоидного ( 2N) пика .

Этот пик называют также "суб-G0G1" или просто субдиплоидным пиком .

Таким образом, ясно, что по интенсивности флуоресценции йодистого пропидия можно определять плоидность ДНК, а значит и апоптоз клеток .

Метод 2. Необходимо отметить, что вышеуказанная методика с применением PI способна зафиксировать лишь поздний апоптоз, тогда как для выявления раннего апоптоза с помощью проточного цитометра чаще всего используют аннексин-V, конъюгированный с флуорохромом ФИТЦ [22] .

Во время апоптоза клетки высвобождают фосфатидилсерин на клеточной поверхности. Аннексин V, являющийся фосфолипидсвязывающим протеином, в присутствии ионов кальция селективно, с высокой аффинностью связывает фосфатидилсерин. Он проявляет очень низкую аффинность к таким фракциям фосфолипидов как фосфатидилэтаноламин, сфингомиелин и фосфатидилхолин. Такой профиль связывания позволяет использовать аннексин-V в качестве высокоспецифичного агента для определения апоптотических клеток [22] .

Комбинация аннексина V/FITC с иодидом пропидия позволяет разделить три различные фенотипа: а) клетки, находящиеся в раннем апоптозе, связываются только с Аннексином-V, б) клетки, одновременно связывающиеся с аннексином V и йодистым пропидием, проходят поздний апоптоз, и в) некротические клетки, которые окрашиваются только йодидом пропидия .

1.9 Иммунологические эффекты продуктов фотоокисления псоралена Известно, что при проведении ПУВА-терапии в коже пациента происходит фотолиз псоралена с образованием продуктов его фотоокисления. Существует предположение, что иммуносупрессия, обусловленная ПУВА-воздействием, может возникать при участии продуктов фотоокисления псораленов, образующихся в ходе реакции IV типа [5; 43] .

В нашей лаборатории было показано, что продукты фотоокисления псоралена обладают иммуносупрессорными свойствами [5; 43] и терапевтическим действием при лечении псориаза и атопической экземы [2;

4] .

Среди продуктов фотолиза водных растворов 8-метоксипсоралена и псоралена были идентифицированы такие, как 6-формил-7гидроксикумарины, гидроксикислоты и гидроксиэфиры, продукты расщепления пиррольного кольца, фурокумариновая кислота и гидроперикись [16]. К сожалению, биологическая активность и свойства большинства фотопродуктов псоралена до сих пор не изучена, и тем самым затруднительно сделать вывод о том, какие именно продукты фотоокисления играют первостепенную роль в иммуносупрессии ГЗТ и КЧ. Тем не менее было показано, что предварительно облученный раствор псоралена при в/в или пероральном введении мышам способен ингибировать Т-клеточный иммунный ответ in vivo у мышей [64]. Это было выявлено на моделях реакций [45; 46], а затем и КЧ [66]. Было доказано, что фотопродукты псоралена с иммуносупрессорными свойствами являются именно продуктами фотоокисления псоралена, поскольку они образовывались только в присутствии кислорода [66]. УФА-облучению непосредственно ни сами животные ни их клетки не подвергались, им вводились продукты фотоокисления псоралена. При такой схеме проведения экспериментов присоединение фотоокисленных псораленов к ДНК не осуществлялось и реакции типа III (см. раздел 1.2) не могли иметь место .

Продукты с иммуносупрессорными свойствами были получены из псоралена, 8-МОП и императорина [2; 44]. Более того, в нашей лаборатории было показано, что механизмы иммуносупрессорного действия продуктов фотоокисления псоралена сходны с таковыми для ПУВА-терапии. Такое предположение было основано на следующих наблюдениях: а) угнетение in vivo пролиферативной активности АГ-специфических Т-лимфоцитов; б) активация клеток с иммуносупрессорным потенциалом; в) индукция адоптивно-переносимой клетками супрессии Т-клеточного иммунного ответа [45]; г) угнетение функций эффекторных АГ-специфических Т-лимфоцитов в отсутствии прямого действия на них; д) отсутствие влияния на гуморальный иммунный ответ. Кроме того известно, что фотопродукты псоралена, выделенные с помощью HPLC-хроматографии, в достаточно большой концентрации in vitro обладают проапоптотической активностью на опухолевую Т-клеточную линию Jurkat [16]. При этом известно, что иммуносупрессорное действие ПУВА-терапия и фотофереза также реализуется, в том числе и через механизм апоптоза Т-клеток [88] .

Тем не менее, до настоящего момента остаются неясными: а) химическая структура фотопродуктов псоралена с иммуносупрессивными свойствами; б) иммунные механизмы супрессорного действия продуктов фотоокисления псоралена на Т-клеточный иммунный ответ in vivo. Такие механизмы удобно изучать на наиболее часто используемой модели Тклеточного иммунного ответа – реакции КЧ. Механизмы ее развития описаны в соответствующем разделе (1.6) .

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Реактивы Псорален – Институт химии растительных веществ, Узбекистан, Ташкент Фосфатный буферный солевой раствор (ФБР) – "ICN" (США) Уксусная кислота, этанол, KI – "Реахим", Россия Хепес-буфер, RPMI-1640, инактивированная телячья сыворотка – "ПанЭко" 2,4-динитрофторбензол (ДНФБ), Оксазалон – "Sigma", США Ацетон – "VEB Laborchemie Apolda" (Германия) .

Гентамицин / Стрептомицин – "ПанЭко", Россия Йодистый пропидий (PI) – Molecular Probe Inc (США) Для приготовления растворов использовали перегнанный этанол и бидистилированную воду .

2.2 Приготовление раствора фотосенсибилизатора и его облучение Маточный раствор псоралена (10-2М) готовили в 96% перегнанном этаноле. Рабочие растворы (1х10-4М и 5х10-5М) получали путем разведения маточного раствора псоралена в ФБР с 1% этанола .

В опытах по изучению фотоиндуцированной агрегации псоралена и ФОП-гемолиза облучение раствора псоралена проводили УФиспускающим светодиодом (США), излучающим OTLH-0480-4V =14,5 преимущественно при 365 нм, нм. Интенсивность света варьировалась от 165 до 840 Вт\м2; доза облучения – от 13,5 до 5760 кДж\м2 .

Облучение растворов псоралена осуществляли при постоянном перемешивании на магнитной мешалке в 1 см кварцевой кювете сбоку (толщина облучаемого образца составляла 1 см). Интенсивность света при длине волны 365 нм измеряли с помощью калиброванного фотоэлемента Power Meter 1815-c, Newport 818-UV(США) .

В опытах на животных рабочий раствор содержал 0,1 мМ псоралена в ФБР с 1% этанола. Последующее облучение рабочего раствора проводили УФА-светом лампы «BlackLight» (Osram, Германия), излучающей преимущественно при 365 нм, при 4оС. Во время экспериментов интенсивность света (при длине волны 365 нм), измеренная с помощью калиброванного фотоэлемента (Power Meter 1815-c, Newport 818-UV, (США)) составляла 23 Вт/м2, доза облучения – 48 кДж/м2 .

2.3 Изучение агрегатного состояния и фотолиза псоралена оптическими методами Для регистрации спектров использовали 1 см кварцевую кювету с 4-мя прозрачными сторонами. Спектры поглощения регистрировали на спектрофотометре «Shimadzu UV-1601» (Япония). Регистрацию спектров флуоресценции, возбуждения флуоресценции и резонансного светорассеяния осуществляли на спектрофлуориметре «Shimadzu RF-1501» .

Измерение спектров РСР производили согласно методике, представленной в работе [91] а именно: регистрацию осуществляли под углом 90° с использованием синхронного режима сканирования настроенных на одну и ту же длину волны монохроматоров спектрофлуориметра .

Кюветодержатель был оснащен двумя вертикальными диафрагмами со щелями шириной 1 мм. Указанные диафрагмы были расположены на уровне центра кюветы на пути пучков возбуждающего и испускаемого света. Таким образом, рассеянный свет собирался из центра кюветы. После регистрации, спектры РСР были исправлены на эффекты внутреннего фильтра и на чувствительность прибора по разработанной в работе [91] методике (подробное описание вносимых исправлений приведено в главе 1.4 раздела Обзор Литературы) .

2.4 Приготовление суспензии эритроцитов и постановка ФОП-гемолиза Взятую с помощью гепаринизированного капилляра из пальца человека кровь разбавляли 10 мл ФБР (pH 7,4). Полученную суспензию эритроцитов трижды отмывали центрифугированием при 2000 об/мин в течение 10 мин .

Отмытые эритроциты разбавляли ФБР до требуемой концентрации (10 6 клеток/мл) .

Раствор фотоокисленного псоралена смешивали с суспензией эритроцитов в объемном соотношении 1:1 при непрерывном перемешивании .

Далее пробы инкубировали при температуре 37оС. В контроле к эритроцитам добавляли раствор необлученного псоралена .

Гемолиз эритроцитов регистрировали в 1 см кювете на спектрофотометре «Shimadzu UV-1601 PC» (Япония) по изменению оптической плотности светорассеняния суспензии эритроцитов при = 670 нм, где отсутствует поглощение света гемоглобином .

Обработка данных ФОП-гемолиза На рисунке 9 представлены типичные кривые гемолиза, индуцированного ФОП. Как видно на рис.9, в зависимости от дозы облучения псоралена индуцируется завершенный, либо незавершенный гемолиз. При завершенном гемолизе (кривая 1) лизируют все клетки суспензии, и значение оптической плотности (при =670 нм) суспензии достигает минимального значения (около 0,03-0,04 отн. ед.). В случае незавершенного гемолиза (кривая 2) лизирует только часть клеток, и значение оптической плотности суспензии выходит на плато, не достигая минимального значения. Параметрами ФОП-гемолиза выступали: амплитуда гемолиза (процент клеток, лизировавших в суспензии эритроцитов) и скорость завершенного гемолиза (величина обратная времени, за которое лизирует 50% клеток) .

Рис. 9. Типичные кривые гемолиза, индуцированного ФОП, и их обработка t50 – время, за которое лизирует 50% клеток 1-гемолитическая кривая, отражающая завершенный гемолиз 2- гемолитическая кривая, отражающая незавершенный гемолиз

2.5 Лабораторные животные, постановка реакции контактной чувствительности В экспериментах были использованы мыши линий СВА (самцы весом 18-20 г., возраст 8-10 недель), полученные из питомника РАМН (Крюково, Московская область). Животные содержались на стандартном пищевом рационе вивария при свободном доступе к воде и пище. Экспериментальные группы животных формировали рандомизировано по 4 мыши в каждой. В контрольные и опытные группы входили мыши одного возраста, полученные из питомника одновременно, разброс по исходной массе животных составлял не более 10%. Все исследования на животных проводили не менее чем в трех повторных сериях опытов, в первой половине дня. Забор селезенки и лимфатических узлов у подопытных животных проводили под глубоким эфирным наркозом. Протокол исследования на животных был одобрен этическим комитетом ГБОУ ВПО РНИМУ им Н.И. Пирогова .

Постановку реакции контактной чувствительности проводили согласно работе [51], с незначительными модификациями. Мышей сенсибилизировали путем аппликации на выбритую за сутки до опыта кожу брюшка 50 мкл 0,3% раствора ДНФБ в ацетоне. Через 6 суток после сенсибилизации на внутреннюю поверхность одного из ушей повторно наносили 5 мкл 0,2% раствора ДНФБ в ацетоне – тест-аппликация (разрешение реакции). На внутреннюю поверхность другого уха в качестве контроля наносили 5 мкл растворителя (ацетона). Через 24 часа после аппликации гаптена у мышей оценивали интенсивность реакции КЧ (отек уха) по разности толщины опытного (аппликация ДНФБ) и контрольного (аппликация ацетона) ушей. Толщину ушей измеряли при помощи микрометра, снабженного световым сигналом. В опытных группах мышам на разные сроки после сенсибилизации ДНФБ вводили по 0,5 мл ФОП или необлученного раствора псоралена. Введение растворов ФОП или необлученного псоралена выполняли перорально или внутривенно .

См. схему постановки реакции КЧ (рис.10) .

Рисунок 10. Схема постановки реакции КЧ .

В группе положительного контроля (К+) сенсибилизированным ДНФБ мышам, вместо облученного псоралена вводили в/в или per os по 0,5 мл ФБР, содержащего 1% этанола. В качестве отрицательного контроля (К-) служила группа интактных (несенсибилизированных ДНФБ) мышей, получивших аппликацию разрешающей дозы ДНФБ (5 мкл 0,2% раствора в ацетоне) .

Интенсивность супрессии реакции КЧ в процентах рассчитывали по формуле:

% супрессии = (1 – (Е – K-)/(K+ - K-))х100% где E,K+,K- – средние значения отека уха у мышей в опытной группе, группе положительного и отрицательного контроля соответственно .

В экспериментах по адоптивному переносу вместо ДНФБ использовали другой гаптен – оксазолон. Для сенсибилизации животных на кожу брюшка наносили 50 мкл 2% раствора оксазолона в ацетоне, для тест-аппликации на ухо мышам наносили 5 мкл 0,4% раствора оксазолона в ацетоне. Остальные условия проведения реакции КЧ были аналогичны КЧ к ДНФБ .

Раствор полной среды для культивации клеточных суспензий содержал в себе среду RPMI 1640 в присутствии АБ (100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина), 10% инактивированной телячьей сыворотки, Lглютамин (2мМ/мл среды), HEPES (10мМ/мл среды). Раствор неполной среды содержал в себе все вышеназванные компоненты кроме инактивированной телячьей сыворотки .

2.6 Приготовление суспензий клеток лимфоузлов и селезенок, оценка абсолютного числа клеток и пролиферации лимфоцитов в лимфатических узлах Мышей усыпляли при помощи эфирного наркоза. Для выделения селезенок мышей, у животных удаляли кожу на левом боку, делали разрез около 1 см, осторожно извлекали орган пинцетом и отпрерарировали ножницами. Для выделения паховых лимфоузлов делали крестообразный разрез на вентральной стороне животного, извлекали органы пинцетом, стараясь минимально захватить окружающую каждый лимфоузел строму .

Органы помещали в охлажденную среду RPMI-1640 c АБ. Далее органы гомогенизировали, и полученную суспензию пропускали через капроновый фильтр для фильтрации стромальных элементов органа. Суспензию клеток дважды отмывали центрифугированием в течении 10 минут при 1200 об/мин (400g). Удаляли надосадок, полученный осадок ресуспендировали в неполной среде .

Подсчет клеток проводили в камере Горяева. Для удобства подсчета ядросодержащих клеток лизировали эритроциты 3% уксусной кислотой .

Для оценки пролиферации лимфоцитов суспензию клеток лимфатических узлов, полученных от ДНФБ-сенсибилизированных мышей, засевали в 96луночный круглодонный планшет в конечной концентрации 106 кл/лунку в полной среде RPMI-1640 (содержащей антибиотик, 10% инактивированную телячью сыворотку, L-глютамин (2 мМ) и 10 мМ Хепес-буфера; pH 7,2) .

Клетки инкубировали 24 ч при температуре 37С и 5% CO2. За 6 ч до окончания культивирования в лунки добавляли радиоактивную метку Н-тимидин (конечная концентрация в лунке 1 мкКю/мл). По истечении времени инкубации клетки из лунок собирали на автоматическом сборщике клеток, перенося радиоактивный материал на стеклянноволокнистые фильтры типа HA-930 (“Whatmann”, Великобритания). Высушенные фильтры помещали во флаконы из кварцевого стекла, содержащие по 4 мл сцинтилляционного раствора (4 г 1ди(5-фенил)-2-оксазолил бензола – PPO и 0,1 г 2,5-дифенилоксазола – POPOP на 1 л толуола). Радиоактивность включенного 3Н-тимидина подсчитывали на счетчике -частиц. Результаты выражали в количестве импульсов в минуту .

2.7 Оценка уровня секреторных цитокинов Мышей двукратно, с промежутком в 24 ч, сенсибилизировали ДНФБ (день 1-й, день 2-й). В день второй и еще через сутки (день третий) опытным группам внутривенно или перорально вводили 0,5 мл ФОП или необлученного псоралена. Контрольной группе в дни второй и третий вводили 0,5 мл ФБР, содержащего 1% этанола. Через 3-4 ч после последнего введения тестируемого агента выделяли паховые лимфатические узлы мышей и готовили суспензии клеток. 106 клеток лимфатических узлов культивировали 24 или 48 ч в присутствии 15 мкг/мл конканавалина А в 96луночных планшетах при 37°C и 5% CO2 в полной среде RPMI-1640. После культивации, методом цитофлюориметрического анализа оценивали внеклеточные концентрации цитокинов согласно инструкции к набору реактивов Mouse Th1/Th2 FlowCytomix Multiplex (“Bender MedSystems”, Австрия). Цитокиновый профиль определяли с помощью проточного цитофлюориметра (“Beckman США) и Cytomics FC-500 Coulter”, программного обеспечения (“Bender FlowCytomix Pro MedSystems”, Австрия) .

Обнаружили, что в контрольных пробах пиковые концентрации цитокинов ИЛ-2, ИЛ-4, ИФН- наблюдались через 24 ч, а ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛИЛ-6, гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) и ФНО- через 48 ч культивирования. В дальнейших сериях экспериментов концентрации вышеуказанных секреторных цитокинов определяли именно через то время культивации (24 или 48 ч), где они должны были достигать своего максимального уровня. ИЛ-1 ни в одной из трех серий экспериментов не был детектирован .

2.8 Оценка апоптоза подготовка суспензии клеток и

in vivo:

цитометрический анализ Суспензии клеток лимфоузлов ДНФБ-сенсибилизированных или интактных мышей готовили, как описано в разделе 2.6. Суспензии клеток выделяли из мышей через 48 и 96 ч после сенсибилизации ДНФБ, получивших ФОП в/в или перорально. Из маточной суспензии отбирали аликвоту, содержащую 106 клеток. Клетки двухкратно отмывали холодным раствором ФБР. Отмытые клетки ресуспендировали в 100 мкл ФБР (4С) и фиксировали 900 мкл 70% глубоко охлажденного этанола (–20С) в течение не менее 30 мин при –20С .

Фиксированные в этаноле клетки осаждали центрифугированием при 300 g 5 минут и ресуспендировали с помощью пипетки с отсеченным наконечником в 500 мкл ФБР и 500 мкл фосфат-цитратного буфера (0,192 М Na 2HPO4, 4 мМ лимонной кислоты, pH=7,8). Инкубировали 5 минут при комнатной температуре. Далее повторно центрифугировали при 300 g, 5 минут и ресуспендировали в 500 мкл «красящего» раствора, содержащего пропидиум йодид (1 мг/мл РНКазы + 33 мкг/мл пропидиум йодида + 0,2% тритон X-100; Sigma, США). Пробы инкубировали 30 минут при комнатной температуре в темноте. По окончании инкубирования образцы с клетками анализировали методом однолучевой проточной цитофлуорометрии при длине волны 488 нм .

Обработка данных проточной цитофлуорометрии. Исследование апоптоза проводили на проточном цитофлуориметре Cytomics FC 500 (Becman Coulter, США), анализируя диаграммы распределения флуоресцирующих клеток .

Типичные диаграммы распределения клеток по флуоресценции ДНК состояли из трех пиков (рисунок 11).

По данным литературы [7] клетки, входящие в состав пиков характеризуются следующим образом:

первый пик (B) – субдиплоидные клетки, вошедшие в апоптоз;

второй пик (C) – покоящиеся, неапоптозирующие диплоидные клетки;

третий пик (D) – тетраплоидные клетки (пролиферирующие клетки) .

Рисунок 11. Типичные диаграмма DotPlot (слева) и гистограмма (справа) флуоресценции мононуклеаров при определении апоптоза. FS – переднее рассеяние, SS – боковое рассеяние .

Увеличение содержания клеток в первом пике свидетельствует об индукции апоптоза, поскольку биохимическим индикатором апоптоза является расщепление ДНК эндонуклеазами на олигонуклеосомальные фрагменты .

Анализировали 10000 событий .

2.9 Оценка апоптоза in vitro Мышей сенсибилизировали ДНФБ, и через 24 или 72 ч готовили суспензии паховых лимфатических узлов. В группе отрицательного контроля (К-) ЛУ выделяли из интактных животных. К суспензиям, содержащих 5 х 106 клеток в ФБР добавляли различные объемы ФОП таким образом, чтобы конечный объем пробы составлял 2 мл и конечные концентрации по псоралену до его облучения составляли 10-6, 10-5, или 5 х 10-5 М. Инкубацию суспензий проводили в течение 15 минут при температуре 37°C и 5% CO2. В контрольных пробах (К+ или К-) 5 х 106 клеток в 2 мл ФБР инкубировали в присутствии 1% этанола. Для определения апоптотической активности необлученного псоралена, к суспензии, также содержащей 5 х 10 6 клеток в ФБР, добавляли 1 мл необлученного агента, в концентрации 10 -4 М (конечная концентрация составляла 5 х 10-5 М). После инкубации, суспензии клеток трехкратно отмывали в неполной среде путем RPMI-1640 центрифугирования (5 мин, 400 g). Затем удаляли супернатант, и осадок, содержащий клетки лимфатических узлов, культивировали в полной среде RPMI-1640 при 37°C и 5% CO2 в течение 4 или 18 ч. После культивации, 5 х 105 клеток были помечены аннексином-V и йодистым пропидием (An/Pi) согласно инструкции к набору реагентов Annexin V-FITC – PI (“Beckman Coulter”, США). Дабы избежать «температурного» апоптоза, все манипуляции, начиная с конца культивации вплоть до постановки пробы в цитофлюориметр, проводили при 4оС. В область (гейт) анализа включали все события за исключением дебриса. Долю AnV+-клеток (ранний апоптоз), AnV+/PI+-клеток (поздний апоптоз) и PI+-клеток (некроз) определяли по стандартной методике на проточном цитофлуориметре Altra (“Beckman Coulter”, США) согласно инструкции производителя .

Интенсивность подачи суспензии в цитофлуориметр подбирали таким образом, чтобы скорость сбора к моменту записи данных составляла 300 событий в 1 с. Анализировали 10000 событий .

2.10 Иммуномагнитная сепарация Для получения отдельных популяций спленоцитов использовали методы негативной и позитивной клеточной селекции (сепарации). Для сепарации СD3+ клеток использовали реактив Dynabeads Mouse pan T (Thy1.2), сепарации B-клеток – Dynabeads Mouse pan B, а для сепарации СD3+, CD4+ и CD8+ – Dynal Mouse Negative Isolation Kit (Invitrogen Dynal AS, Норвегия) (рисунок 12). Для сепарации отдельной популяции лимфоцитов (CD3+, CD4+, CD8+, CD45R) из 107 клеток, к суспензии спленоцитов в 100 мкл «буфера 1»

(ФБР без Ca2+ и Mg2+, 0,1% фетальной сыворотки, 2 мМ ЭДТА, pH 7,4) добавляли 20 мкл смеси моноклональных антител против поверхностных антигенов клеток, которые следовало удалить. После тщательного перемешивания, содержимое пробирки инкубировали 20 мин при 4°C. На следующем этапе клетки отмывали путем добавления 2 мл «буфера 1» и центрифугирования (300 g, 8 мин.) при 4°C. После отбора супернатанта клетки ресуспендировали в 800 мкл «буфера 1». Следующим шагом было добавление парамагнитных полимерных микрочастиц Dynalbeads и инкубация с постоянной ротацией в течение 15 мин. при 18-25°C. Затем содержимое пробирки разбавляли добавлением 1 мл «буфера 1» и оставляли в магнитном поле штатива DynalMag-2 (Invitrogen Dynal AS, Норвегия) на 2 мин. После чего собирали супернатант, содержащий интересующую популяцию клеток, не прикрепившуюся к полимерным микрочастицам, и отмывали центрифугированием в ФБР. После подсчета клетки вводили внутривенно экспериментальным животным в объеме 0,5 мл .

Контроль чистоты популяции осуществляли методом проточной цитометрии с использованием флюорохром-меченых моноклональных антител (анти-CD3+, -CD4+, -CD8+ и анти-45R) к поверхностным маркерам лимфоцитов мышей (Invitrogen, США) .

Рисунок 12. Принцип иммуномагнитной сепарации лимфоцитов. Пояснения в тексте .

2.11 Статистическая обработка результатов Результаты обрабатывали методами вариационной статистики с соответствующими расчетами среднего арифметического значения, стандартного отклонения (n-1) и стандартной ошибки среднего значения (SEM) .

, где Xi - опытное значение, - среднее значение, n – число опытов .

Достоверность различий между опытными и контрольными группами в иммунологических экспериментах на мышах определяли по критерию Стьюдента с использованием программы "Statistica 7" для Windows Vista .

Различия считались достоверными при р 0,05, где р - уровень значимости .

Глава 3 . РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 АГРЕГАЦИЯ ПРОДУКТОВ ФОТООКИСЛЕНИЯ ПСОРАЛЕНА

3.1.1 Фотоиндуцированная агрегация псоралена, спектры РСР Ранее, при исследовании гемолиза эритроцитов под действием фотоокисленного псоралена была высказана гипотеза, что повреждение мембран происходит при участии агрегатов фотопродуктов псоралена [65] .

Однако, при выполнении указанной работы сами агрегаты фотопродуктов обнаружены не были. В настоящее время появился физический метод, позволяющий с высокой чувствительностью обнаруживать агрегаты красителей – метод резонансного светорассеяния [60]. Исходя из этого, в настоящей работе были проведены измерения спектров РСР необлученных и УФА-облученных растворов псоралена (рис.13). На рисунке 13 приведены исправленные спектры РСР необлученного и облученного псоралена (доза облучения 40 кДж/м2). Концентрация исходного псоралена составляла 0,1 мМ. На спектре необлученного псоралена виден небольшой максимум около 300 нм, причем он совпадает с максимумом спектра поглощения необлученного псоралена (рис.14). По-видимому, это говорит о том, что псорален в этой концентрации формирует небольшое количество агрегатов .

После облучения псоралена появляется широкая и очень интенсивная полоса сигнала РСР продуктов его фотоокисления. Заметим, что здесь идет речь именно об агрегации фотопродуктов, а не исходного псоралена. Дело в том, что если бы при УФА облучении комплексировались молекулы нативного псоралена, то возникающая полоса РСР располагалась бы в области поглощения псоралена и не простиралась далее 400 нм. Однако, как видно на рисунке 13 полоса РСР достигает 500 нм и, по-видимому, простирается еще дальше. На спектре поглощения раствора облученного псоралена в области за 400 нм появляется полоса поглощения фотопродуктов. Это указывает на то, что спектр РСР формируется с участием фотопродуктов псоралена, поглощающих не только в УФ, но и в видимой области спектра .

Рисунок 13. Фотоиндуцированная агрегация псоралена (0,1 мМ) в ФБР растворе после УФА-облучения (интенсивность при 365 нм составляла 270 Вт/м2, доза облучения — 40 кДж/м2) .

Рисунок 14. Спектры поглощения псоралена (10-4М в ФБР с 1% этанола) до (сплошная кривая) и после (пунктирная кривая) облучения. Интенсивность при 365 нм=270 Вт/м2, доза – 40 кДж/м2. Стрелками указаны направления изменения оптической плотности псоралена после облучения .

Как видно на рисунке 13, в исправленном спектре РСР ФОП можно отчетливо выделить, по крайней мере, три максимума около 300, 350 и 450 нм. Исходя из указанного факта, возникает вопрос – являются ли эти максимумы истинными максимумами РСР, или образуются вследствие неких оптических артефактов? Возможно, что при фотолизе псоралена образуются флуоресцирующие продукты, и если у этих флуоресцирующих фотопродуктов выражена антистоксовская область, т.е. область в которой перекрываются спектры возбуждения и испускания флуоресценции, то именно флуоресценция в антистоксовской области могла давать вклад в формирование максимумов спектра РСР. Дело в том, что при измерении сигнала РСР оба монохроматора флуориметра настроены на одну и ту же длину волны (см. раздел материалы и методы) и в антистоксовской области будет происходить как возбуждение, так и регистрация флуоресценции .

Вопросу о том, как такое предположение можно проверить, посвящен следующий раздел .

3.1.2 Измерение спектров возбуждения и эмиссии флуоресценции продуктов фотоокисления псоралена На рисунке 15 представлены спектры возбуждения и испускания флуоресценции ФОП. Как видно на указанном рисунке, после УФ-А облучения псоралена определяются, по крайней мере, три флуоресцирующих фотопродукта. Рассмотрим спектры этих фотопродуктов двигаясь из коротковолновой области в длинноволновую. Первый (самый коротковолновый) продукт имеет максимум испускания около 325 нм, и максимум возбуждения около 290 нм. У этого фотопродукта явно видна антистоксовская область, располагающаяся около 300-310 нм. Спектр испускания следующего (второго) флуоресцирующего фотопродукта накладывается на спектр испускания необлученного псоралена (последний на графике не приведен). Здесь также видна антистоксовская область в районе 350 нм. Третий фотопродукт имеет максимум испускания около 470 нм, а возбуждения около 430 нм. Опять же, здесь явно выражена антистоксовская область около 450 нм .

Рисунок 15. Спектры возбуждения и испускания флуоресценции ФОП (5.10-5М в ФБР, 270 Вт/м2, 135 кДж/м2). Пунктирные кривые – спектры эмиссии, сплошные – спектры возбуждения. Около каждого из спектров испускания флуоресценции указана длина возбуждающего света, около каждого спектра возбуждения указана длина волны регистрируемой флуоресценции .

Необходимо отметить, что на рисунке 15 представлены неисправленные спектры флуоресценции. Поэтому соотношения интенсивности флуоресценции этих трех фотопродуктов не соответствуют действительности. Это связано с тем, что в коротковолновой области чувствительность флуориметра меньше, чем в длинноволновой, что приводит к занижению интенсивности сигналов коротковолновых продуктов по сравнению с длинноволновыми .

Из полученных результатов измерения спектров возбуждения и эмиссии флуоресценции ФОП следует, что максимумы в спектрах РСР ФОП могут быть обусловлены флуоресценцией фотопродуктов в антистоксовских областях около 300, 350 и 450 нм .

3.1.3 Влияние тушения флуоресценции на РСР фотопродуктов псоралена Для подтверждения высказанной выше гипотезы в настоящей работе были проведены опыты с тушением флуоресценции (в качестве тушителя флуоресценции был выбран KI). Для решения поставленной задачи первоначально был решен вопрос выбора оптимальной концентрации тушителя .

Опираясь на возможность наличия электростатических взаимодействий в агрегатах, представляется возможным предполагать, что добавление соли (KI) может вызвать дезагрегацию комплексов фотопродуктов. Поэтому, необходимо было подобрать такую концентрацию KI, которая, с одной стороны, значительно бы тушила флуоресценцию, а с другой стороны была бы как можно меньше для того, чтобы не вызвать развал агрегатов из-за ослабления электростатических взаимодействий в них при добавлении соли и, тем самым, не привести к значительному ослаблению сигнала РСР .

Рисунок 16. Спектры испускания флуоресценции псоралена (10-4 М) после его УФА облучения (67,5 кДж/м2, 270 Вт/м2). Стрелка показывает направление изменения интенсивности флуоресценции при добавлении KI в концентрациях (М), указанных числами рядом со стрелкой. Флуоресценцию возбуждали при 430 нм .

Рисунок 17. Зависимость интенсивности флуоресценции ФОП при 470 нм от концентрации KI (по данным рис. 13) .

Для решения этой проблемы была получена кривая зависимости интенсивности флуоресценции длинноволнового максимума 470 нм от концентрации добавляемого тушителя (рис. 17). На её основании была выбрана концентрация KI 0,3 М, т.к. такое количество тушителя снижает флуоресценцию более чем на 80% от исходного значения (рисунок 17) .

Тушение флуоресценции принято представлять в координатах ШтернаФольмера. В таких координатах зависимость чаще всего бывает линейной .

Если представить данные рис. 17. в координатах Штерна-Фольмера, то видно, что линейной зависимости здесь нет (рис. 18). Начальный участок кривой (до концентрации KI равной 0,2 М) имеет зависимость близкую к линейной. Однако с увеличением концентрации тушителя константа ШтернаФольмера резко возрастает. Если предположить, что флуорофор, обеспечивающий флуоресценцию с максимумом испускания 470 нм, находится внутри агрегата и к нему затруднен доступ тушителя, то такое поведение кривой Штерна-Фольмера может иметь следующее объяснение – увеличение концентрации соли приводит к увеличению доступности этого флуорофора за счет ослабления KI электростатических взаимодействий внутри агрегатов фотопродуктов. Поэтому при высоких концентрациях KI константа Штерна-Фольмера и наклон кривой возрастает .

Рисунок 18. Тушение флуоресценции фотопродукта с максимум испускания 470 нм KI в координатах Штерна-Фольмера (представлена типичная кривая). Кривая получена по данным рис 13. F0- интенсивность флуоресценции без тушителя. Fq – интенсивность флуоресценция в присутствии тушителя .

Это подтверждается данными рисунка 19, на котором представлены спектры РСР ФОП до и после добавления тушителя. Видно, что амплитуда спектра РСР ФОП после добавления KI падает, при этом сама форма спектра в основном сохраняет свою структуру. Однако максимум при 450 нм полностью исчезает. Увеличение константы Штерна-Фольмера с ростом концентрации KI может быть обусловлено еще одним фактором. Дело в том, что проведение самого опыта заключалось в последовательном добавлении к одному и тому же раствору ФОП сухих навесок KI. После добавления каждой навески проводилась регистрация флуоресценции .

Рисунок 19. Спектры РСР псоралена (10-4 М) после его УФА облучения (200 кДж/м2, 800 Вт/м2) в присутствии тушителя флуоресценции (ФОП+KI, штрихованная кривая) и без тушителя (ФОП без KI, сплошная кривая). Отчетливо видно исчезновение максимума 450 нм .

Таким образом, весь процесс получения кривой Штерна-Фольмера занимал примерно час времени. В следующем разделе будет показано, что агрегаты ФОП во времени спонтанно распадаются, причем за 60 минут хранения этот распад достигает значительной величины. Естественно, что при таком распаде доступность флуорофора к тушителю также может возрастать .

Таким образом, из полученных результатов можно сделать вывод о том, что длинноволновый максимум 450 нм на спектрах РСР ФОП обусловлен флуоресценцией в антистоксовской области одного из продуктов фотоокисления псоралена; при этом экстремумы около 300 и 350 нм, повидимому, не обусловлены флуоресценцией фотопродуктов псоралена .

3.1.4 Стабильность фотоиндуцированных агрегатов псоралена во времени Следующей задачей настоящей работы было исследование стабильности агрегатов ФОП, регистрируемых методом РСР, во времени .

Для этого измеряли спектры РСР ФОП сразу после облучения раствора псоралена (0 минут), а затем спустя 15, 30, 45, 60, 75, 90 и 120 минут его хранения при комнатной температуре. Как видно из рисунка 20, хранение образца в темноте в течение двух часов приводит к очень существенному падению сигнала РСР .

Рисунок 20. Спектр РСР ФОП (10-5 М, 270 Вт/м2, 80 кДж/м2) в зависимости от времени его хранения. Стрелкой указано направление падения сигнала в течение 120 минут. На вставке изображено падение сигнала РСР ФОП при 3-х длинах волн (300, 350 и 450 нм) от времени хранения образца .

Обнаруженное существенное падение сигнала РСР ФОП во времени навязало дополнительную стратегию в дальнейших опытах по измерению РСР .

Следующей задачей настоящей работы было исследовать кинетику снижения сигнала РСР ФОП. Для этого каждые 15 секунд в течение 30 минут хранения измеряли сигнал РСР облученного УФА раствора псоралена (концентрация 0,1 М, интенсивность 270 Вт/м2, доза – 40 кДж/м2) при следующих длинах волн: 290, 300, 320, 330, 350, 370, 410, 440, 450 и 470 нм .

Каждые 8 минут с момента начала измерений получали спектры поглощения данной пробы ФОП, причем время измерения таких спектров занимало 2 минуты. Такая стратегия настоящих измерений была выбрана по причине того, что для получения исправленных спектров РСР необходимы данные спектров поглощения. Таким образом, были получены исправленные величины сигналов убыли РСР ФОП при указанных выше длинах волн .

После логарифмирования последних, было обнаружено, что они хорошо аппроксимируются линейной регрессией. Величина наклона полученных прямых пропорциональна скорости уменьшения сигнала РСР. Также были рассчитаны оценки и доверительные интервалы для угловых коэффициентов полученных прямых (скорости уменьшения логарифма сигнала РСР ФОП) .

Полученные результаты представлены на рисунке 21 .

Рисунок 21. Зависимость скорости убыли логарифма сигнала РСР от длины волны .

На вставке указан пример определения скорости убыли логарифма сигнала РСР на примере одной длины волны (300 нм,*) .

Видно, что скорость убыли сигналов РСР практически не зависит от длины волны за исключением узкой области около 450 нм, где сигнал убывает медленнее всего. Это указывает на то, что сигнал около 450 нм имеет другую природу, чем в остальной спектральной области. Действительно, как было показано выше (рис.19), при 450 нм значительный вклад в сигнал РСР дает флуоресцирующий фотопродукт псоралена. Согласно прямым данным флуориметрических измерений фотопродукт, имеющий антистоксовскую область около 450 нм, значительно стабильнее, чем агрегаты фотопродуктов, дающие сигнал РСР .

Измеряя спектры испускания флуоресценции фотопродукта с максимумом 470 нм (на спектрах РСР он проявляется в виде максимума около 450 нм) через 2 часа его хранения, было обнаружено совсем небольшое снижение интенсивности сигнала и заметное изменение его формы (рисунок 22) .

Флуоресценция, отн. ед .

–  –  –

Рисунок 22. Спектры испускания флуоресценции фотопродукта псоралена с максимумом флуоресценции 470 нм. Пунктирная кривая - сразу после облучения .

Сплошная кривая – после 120 минут хранения .

Обычно спектры флуоресценции очень чувствительны к микроокружению флуорофора [1]. Таким образом, изменение формы сигнала испускания флуоресценции ФОП при 470 нм может свидетельствовать о распаде агрегатов, внутри которых содержался данный флуорофор, что приводит к изменению его микроокружения и, соответственно, спектра испускания. Эти же процессы, связанные с изменением микроокружения флуорофора, могут быть ответственны за увеличение наклона кривой Штерна-Фольмера (см. рисунок 18) .

3.1.5 Измерение сигналов РСР при разведении ФОП Ранее, в работе [46] при проведении ФОП-гемолиза, раствор ФОП в ФБР смешивали с суспензией эритроцитов (также находящейся в ФБР) в соотношении 1:1. Таким образом, производилось разведение ФОП в 2 раза .

Исходя из этого, в настоящей работе было изучено, как такое разведение повлияет на интенсивность РСР, а также на кинетику распада агрегатов ФОП при хранении образца .

Для этого из маточного раствора псоралена с концентрацией 10 -4 М в ФБР, содержащем 1% этанола, отбирали 3 мл, которые подвергались УФА облучению (270 Вт/м2, 67,5 кДж/м2). Производилось измерение сигнала РСР при 290 нм в течение 120 минут. Далее из маточного раствора псоралена отбирали 3 мл, облучали аналогичным способом и разбавляли его ФБР в два раза, измеряли сигнал РСР при 290 нм в течение 120 минут. На рисунке 23 видно, что разбавление ФОП в два раза приводило к падению сигнала РСР в 2,09 раза, что возможно говорит об уменьшении количества агрегатов вдвое .

Рисунок 23. Значения сигнала РСР ФОП (10-4 М) при 290 нм при его разведении ФБР в 2 раза. На рисунке указано также значение сигнала РСР при 290 нм в отсутствии разведения раствора ФОП при аналогичном времени хранении (3 минуты) .

На рисунке 24 представлены зависимости падения сигнала РСР при 290 нм нативного раствора облученного псоралена (10-4 М) и этого же раствора, разведенного в 2 раза ФБР после его облучения от времени хранения. Обе кривые нормировались к своей начальной интенсивности. Таким образом, было обнаружено, что скорость убывания сигнала РСР ФОП после его разбавления увеличилась. Последнее вероятно говорит об увеличении скорости распада агрегатов .

Рисунок 24. Зависимость сигналов РСР ФОП (10-4 М, 270 Вт/м2, 67,5 кДж/м2) при 290 нм от времени хранения. Верхняя кривая – неразведенный образец, нижняя – разведенный в два раза фосфатно-буферным раствором. Обе кривые нормированы к начальной интенсивности РСР .

Можно сравнить полученные в настоящей работе данные по стабильности фотоиндуцированных агрегатов псораленов после разведения ФОП в отношении 1:1 ФБР (нижняя пунктирная кривая, рисунок 24) с литературными данными по убыванию гемолитического эффекта ФОП во времени (рисунок 25) [65]. Необходимо отметить, что в указанной работе [65] раствор ФОП также смешивали с суспензией эритроцитов в ФБР в отношении 1:1. Видно, что за 2 часа хранения ФОП примерно вдвое падает как сигнал РСР ФОП (рис. 24), так и гемолитическая эффективность ФОП (рис. 25) .

Рисунок 25. Зависимость гемолитического эффекта ФОП от времени его хранения (согласно данным работы [65]) .

3.1.6. Зависимость фотоиндуцированной агрегации псоралена от дозы УФА-облучения .

В настоящем разделе была поставлена задача изучить зависимость сигнала РСР ФОП от времени (дозы) его облучения .

Раствор псоралена в концентрации 10-4М в ФБР облучали в течение двух часов, проводя измерения спектров РСР через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 15, 20, 30, 50, 80 и 120 минут после начала его облучения (каждое измерение занимало около 1 минуты) .

На рисунке 26 представлены полученные спектры. Как видно из представленного ниже рисунка, в диапазоне первых 10 минут облучения псоралена (сплошные кривые) происходит возрастание спектров РСР, причем максимум сигнала наблюдается на 7-10 минутах облучения (для разных длин волн). Видно, что при облучении раствора дольше 10 минут (пунктирные кривые) сигнал РСР начинает падать как в коротковолновой, так и в длинноволновой областях. На основе ранее проведенного эксперимента по стабильности агрегатов во времени можно предположить, что при слишком длительном времени облучения агрегаты начинают претерпевать распад .

Падение же максимумов РСР-спектров в коротковолновой области при облучении более 7 минут, можно объяснить тем, что при таких временах облучения (дозах) в растворе могут образоваться продукты вторичного фотоокисления .

Рисунок 26. Спектры РСР растворов псоралена(10-4 М), облученных в течение различного времени (различными дозами). Раствор псоралена (0,1 мМ в ФБР) облучали УФАизлучением (365 нм, интенсивность – 840 Вт/м2). Сплошные кривые – облучение раствора до 7 минут включительно; пунктирные кривые – облучение свыше 10 минут .

Стрелками показано изменение сигнала РСР в зависимости от времени облучения:

сплошной стрелкой – возрастание сигнала РСР при облучении до 7 минут, пунктирной стрелкой – убывание сигнала РСР при облучении дольше 7 минут. В скобках указана полученная доза .

На рисунке 27 показана зависимость величины сигнала РСР

ФОП-раствора от времени облучения (дозы облучения) при 4-х длинах волн:

290, 350, 410 и 450 нм .

Как видно из рисунка 27, значения РСР при указанных длинах волн достигают своего максимума приблизительно при одном времени облучения

– 7 минут. Возможны следующие объяснения этого факта:

после 7 минут облучения раствора псоралена образование агрегатов 1) замедляется из-за уменьшения концентрации псоралена, и начинает доминировать фотохимический распад агрегатов, состоящих из поглощающих УФА-излучение фотопродуктов;

в растворе ФОП после 7 минут облучения скорость темнового распада 2) агрегатов начинает превышать скорость их фотохимического образования;

меняется структура агрегатов – ослабляются экситонные 3) взаимодействия .

Рисунок 27. Зависимости сигнала РСР раствора псоралена, облученных в течение различного времени (различными дозами), для 4 длин волн: 290 нм, 350 нм, 410 нм и 450 нм. Раствор псоралена (0,1 мМ в ФБР) облучали УФА-излучением (365 нм, интенсивность – 840 Вт/м2) .

Видно, что кривые достигают максимума при времени облучения 7-10 минут .

Также стоит отметить, что существует явная разница в спектрах РСР, наблюдаемых при хранении раствора ФОП (рис. 20) и его длительном облучении (рис. 26). В отличие от спектров при хранении спектры РСР при длительном облучении не просто начинают падать в амплитуде, но и изменяют форму спектра в коротковолновой области, причем падение сигнала в этой области намного сильнее, чем при хранении ФОП. Это еще раз подтверждает предположение о наличии продуктов вторичного фотоокисления в растворе ФОП после длительного облучения .

3.1.7 Зависимость фотоиндуцированной агрегации псоралена от интенсивности УФА-излучения и концентрации псоралена во время облучения Зависимость сигнала РСР от интенсивности УФА-облучения псоралена Известно, что выход продуктов ФОП ответственных за гемолиз эритроцитов (гемолизинов) возрастает при увеличении интенсивности облучения, или концентрации облучаемого раствора псоралена [46]. В этой связи было изучено влияние интенсивности облучения раствора псоралена на степень его агрегатообразования (рисунок 28). Для этого раствор псоралена в концентрации 10-4М в ФБР облучали при двух интенсивностях – 270 и 165 Вт/м2, соответственно. Времена облучения подбирались так, чтобы поглощенные дозы были одинаковыми при вышеуказанных интенсивностях .

Набор поглощенных доз при двух разных интенсивностях был одинаковым .

Сопоставляя данные рисунка 28 видно, что с помощью высокой интенсивности (270 Вт/м2) можно добиться большей агрегации продуктов фотоокисления псоралена, по сравнению с меньшей интенсивностью (165 Вт/м2) при одинаковых поглощенных дозах. Таким образом образование агрегатов продуктов фотоокисления псоралена зависит от интенсивности так же, как и образование ФОП-гемолизинов. Если построить зависимость сигналов РСР от дозы облучения при разных длинах волн (см. вставки на рис. 28) вызывает интерес тот факт, что при малой интенсивности облучения кривая зависимости величины сигнала РСР ФОП от дозы облучения начинает падать после 40 кДж/м2. Вероятнее всего это объясняется тем фактом, что при слишком длительном времени облучения агрегаты начинают разваливаться (см раздел 3.1.4) .

Рисунок 28. Спектры РСР ФОП (10-4 М) облученного при двух интенсивностях – 270 Вт/м2 (верхний спектр) и при 165 Вт/м2 (нижний спектр). Значения около стрелок показывают порядок увеличения сигнала РСР при различных поглощенных дозах. На вставках для обеих интенсивностей показана зависимость величины сигнала РСР ФОП от дозы облучения при 4-х длинах волн: 300, 340, 350 и 450 нм .

Зависимость величины сигнала РСР от концентрации псоралена .

Также было изучено влияние концентрации псоралена на агрегацию его фотопродуктов. Для этого были приготовлены два раствора псоралена в ФБР, содержащих 1% этанола в следующих концентрациях – 10-4М и 5х10М. Далее они подвергались облучению в падающих на поверхность образца дозах 67,5 кДж/м2 и 135 кДж/м2 при одинаковой интенсивности – 270 Вт/м2 (рис 27). Такие дозы были выбраны для того, чтобы в обоих растворах (с разными концентрациями) количество поглощенных фотонов (Dпогл) было одинаковым.

Эти дозы рассчитывались следующим образом:

Dпогл=D0-Dпрошед = D0(1-Dпрош/D0), отсюда Dпогл= D0(1-T365), где D0, Dпогл, Dпрошед – падающая, поглощенная и прошедшая дозы соответственно; T365 – пропускание образца при 365 нм .

Полученные данные (рисунок 29 А и Б) свидетельствуют о том, что при увеличении концентрации облучаемого псоралена увеличивается эффективность образования агрегатов его фотопродуктов. Такая же зависимость ранее была показана для образования ФОП-гемолизинов [46] .

Рисунок 29. Спектры РСР ФОП (270 Вт/м2) в двух концентрациях: 10-4 М (А) и 5,10М (Б). Стрелки показывают направление увеличения сигнала РСР ФОП в зависимости от времени его облучения .

3.1.8. Исследование спектров РСР и гемолитической активности ФОП при облучении псоралена в бескислородной среде и в присутствии кислорода .

Известно, что с участием фурокумаринов могут протекать реакции, не зависящие от присутствия и приводящие к ковалентному O2 фотоприсоединению ФК к белкам, нуклеиновым кислотам и липидам, а также к реакциям фотоприсоединения между молекулами псоралена [83] .

В настоящей работе была поставлена задача исследовать как меняется сигнал РСР при облучении раствора псоралена в кислородсодержащей (рисунок 30) и бескислородной среде (рисунок 31), параллельно определяя гемолитическую активность полученных растворов на суспензии эритроцитов .

Рисунок 30. Зависимость сигнала РСР от времени облучения в кислородсодержащей среде (верхний график); кинетика сигнала РСР в зависимости от времени облучения для длин волн: 300 нм, 350 нм и 450 нм (нижний график) .

Раствор псоралена (0,1 мМ в ФБР) облучали УФА-излучением (365 нм, интенсивность – 840 Вт/м2). Результаты трех независимых экспериментов .

Рисунок 31. Зависимость сигнала РСР от времени облучения в бескислородной среде (график А); кинетика сигнала РСР в зависимости от времени облучения для длин волн: 300 нм, 350 нм и 450 нм (график Б) .

Раствор псоралена (0,1 мМ в ФБР) облучали УФА-излучением (365 нм, интенсивность – 840 Вт/м2) .

Для облучения псоралена в бескислородной среде раствор предварительно барботировался инертным газом аргоном (Ar) в течение 30-35 минут, не допуская при этом попадания в кювету «нового» кислорода извне. Для этого на кювету устанавливалась насадка с двумя отверстиями: через одно в раствор псоралена опускалась игла, через которую подавался аргон, через другое отверстие уходил вытесняемый газ .

Ранее в нашей лаборатории было обнаружено, что ФОП-гемолиз происходит только в присутствии псоралена, облученного на воздухе [64] .

Как и ожидалось, в настоящем эксперименте наблюдалось наличие ФОПгемолиза при добавлении псоралена, облученного в присутствии кислорода, и отсутствие процесса гемолиза при добавлении псоралена, облученного в бескислородной среде .

Как видно из рисунков 30 и 31, сигнал РСР при фотоиндуцированной агрегации псоралена на воздухе был значительно ниже, чем сигнал РСР при фотоиндуцированной агрегации в аргоне. Следовательно, в присутствии кислорода наблюдается ослабление сигнала РСР .

Причины этого ослабления сигнала могут быть разные .

Предположим, что в аргоне и на воздухе идут одни и те же реакции .

Кислород тушит электронно-возбужденное, скорее всего триплетное состояние псоралена, т.к. кислород очень хороший тушитель триплетных состояний (константа тушения – диффузионная, т.е. при первом столкновении молекулы кислорода с триплетно-возбужденной молекулой последняя инактивируется и передает энергию на кислород), что приводит к ослаблению сигнала РСР .

Кроме того, нельзя исключать другие возможные механизмы такого ослабления сигнала РСР, как разная структура агрегатов и качество продуктов, образовавшихся на воздухе и в аргоне. О наличии таких различий можно судить по спектрам РСР (рисунок 30 и 31): при облучении на воздухе спектр РСР полученного раствора приподнят в длинноволновой части спектра (больше 400 нм) (сигнал в обоих случаях мал, но при облучении на воздухе – заметно больше); наоборот, при 300 нм максимум в присутствии кислорода сильно занижается и, возможно, частично сдвигается (о чем сложно судить в связи с техническими ограничениями приборов) .

Также возможно, что в присутствии кислорода образуются агрегаты другого качества по отношению к таковым в отсутствии кислорода, с другой упаковкой молекул, с другим, возможно менее выраженным экситонным взаимодействием между -электронными системами «слипшихся», агрегировавших молекул, что вероятно может повлиять на сигнал РСР .

Проверить, что здесь происходит, имея только данные РСР, не представляется возможным. При росте линейного размера (если все остальные характеристики одинаковы) сигнал РСР будет расти пропорционально квадрату линейного размера (не объёма) [60]. Однако, если агрегаты разные, если у них разная упаковка, то на РСР будет сказываться не только линейный размер, но и характер взаимодействий мономеров в агрегате .

Прямых данных о размерах агрегатов с помощью тех методов и приборов, которые были использованы в настоящей работе, получить не представлялось возможным. Для того чтобы получить эту информацию, нужно привлекать другие методы, например, динамическое светорассеяние .

Однако нельзя полностью отвергать сходство реакций в аргоне и на воздухе:

спектры РСР имеют те же максимумы: 300 и 350 нм. Конечно, есть различия в амплитудах сигналов, однако сами максимумы наблюдаются примерно при тех же длинах волн .

Предположим, что продукт, дающий вклад в максимум при 300 нм, хуже образуется в присутствии кислорода, т.е. наблюдается явление тушения, или ингибирования, реакции образования продуктов, которые дают вклад в максимум спектра РСР при 300 нм в присутствии кислорода. Если речь идет о тушении, то тушителем, очевидно, является молекулярный кислород (т.к. это единственный агент, который либо присутствует, либо нет;

аргон – инертный газ и ни с чем не взаимодействует) .

Процессы тушения описываются известным уравнением ШтернаФольмера, изначально выведенным для тушения флуоресценции, но которое также можно применять и к другим реакциям, в том числе и к фотохимическим .

Согласно уравнению Штерна-Фольмера:

–  –  –

тушения, – время затухания флуоресценции в отсутствии тушителя, [T] – концентрация тушителя .

В настоящем случае тушителем является молекулярный кислород, концентрация которого в водных растворах в равновесии с воздухом составляет 0,510-3 М, а фотопродуктами, подвергаемыми тушению, могут быть синглетные (= 1-4 нс [61]) или триплетные состояния псоралена (= 2-7 мкс [20]). Известно, что фотодинамические реакции сенсибилизаторов осуществляются через триплетные электронновозбужденные состояния [1]. Но ничего не известно о том, какие возбужденные состояния псоралена участвуют в формировании фотоиндуцированных агрегатов, обнаруживаемых методом РСР. Примем, что константа тушения электронно-возбужденных состояний псоралена диффузионная (~109 М-1с-1). Проведем оценку времени жизни возбужденных состояний, используя уравнение Штерна-Фольмера .

Наибольшее ослабление сигнала РСР в присутствии молекулярного кислорода наблюдается в максимуме спектра РСР около 300 нм. Отношение сигналов РСР при облучении (420 с, рис. 30 и 31 в аргоне и на воздухе составляет 37:22=1,7. Отсюда, на основании уравнения Штерна-Фольмера, время жизни подвергаемых тушению фотопродуктов составляет 2,710 -6 с .

Этот результат расчета указывает на то, что в агрегации фотопродуктов псоралена в отсутствие кислорода, также как и в фотодинамических реакциях, участвуют триплетные возбужденные состояния псоралена .

Возникающие при взаимодействии с возбужденным псораленом активные формы кислорода (супероксиданион радикал и синглетный кислород) могут взаимодействовать с молекулами псоралена и приводить к появлению продуктов фотоокисления псоралена, играющим ведущую роль в ФОПгемолизе .

Рисунок 32. Дозовая зависимость амплитуды ФОП-гемолиза при добавлении псоралена, облученного в присутствии кислорода .

Раствор псоралена (0,1 мМ в ФБР) облучали УФА-излучением (365 нм, интенсивность – 840 Вт/м2) .

Сплошной линией обозначена кривая амплитуд гемолиза при облучении на воздухе, пунктирной линией – при облучении в бескислородной среде .

При ФОП-гемолизе полученные в настоящей работе данные (рис. 32) полностью совпадают с литературными. Гемолиз идет только под действием продуктов, полученных при облучении псоралена в присутствии кислорода (рис. 32, верхняя кривая), и практически не идет в присутствии продуктов, полученных в бескислородной среде (рис. 32, нижняя кривая) (т.к. кислород невозможно полностью удалить из водного раствора перед облучением) .

3.1.9 Проверка выполнимости закона Бунзена-Роско при фотоиндуцируемой агрегации псоралена и при образовании ФОПгемолизинов .

В настоящем разделе была поставлена задача определить выполнимость закона взаимозаменяемости (закон Бунзена-Росно) при УФАоблучении растворов псоралена при разных интенсивностях (180 Вт/м 2 и 840 Вт/м2) .

Как видно из рисунков 33 и 34, максимумы дозовых зависимостей сигнала РСР наблюдаются приблизительно при одинаковых дозах облучения .

При этом сигналы сильно отличаются по амплитуде для различных интенсивностей облучения: сигнал от ФОП, облученного при меньшей интенсивности, ослаблен приблизительно в 3,5 раза по сравнению с таковым при высокой интенсивности при дозах облучения более 100 кДж/м2 .

В чем причина наблюдаемых различий? При выполнении настоящей работы было показано, что фотоиндуцированные агрегаты не стабильны и разрушаются при хранении (см. рис. 20). Во время облучения наряду с образованием агрегатов также должен происходить их темновой распад. Чем ниже интенсивность, тем дольше облучается образец и тем больше агрегатов успеет разрушиться, что должно привести к ослаблению сигнала РСР .

Для дозы ~200 кДж/м2 длительность облучения составляла около 4 и 19 минут при интенсивностях 840 Вт/м2 и 180 Вт/м2, соответственно. Таким образом, при дозе 200 кДж/м2 облучение при низкой интенсивности длится примерно на 15 минут дольше, чем при высокой. По данным рисунка 19 за такое время за счет темнового распада должно произойти ослабление сигнала РСР на ~15%. На самом деле (рис. 34) ослабление сигнала РСР при низкой интенсивности облучения происходит значительно сильнее – примерно на 60 % по сравнению с облучением при высокой интенсивности .

Рисунок 33. Спектры РСР при интенсивностях облучения180 Вт/м2(А) и 840 Вт/м2 (Б). Раствор псоралена (0,1 мМ в ФБР) облучали УФА-излучением (365 нм) .

Рисунок 34. Дозовые зависимости сигнала при интенсивностях облучения 180 Вт/м2 и 840 Вт/м2 .

Раствор псоралена (0,1 мМ в ФБР) облучали УФА-излучением (365 нм) .

График дозовой зависимости сигнала РСР псоралена, облученного при интенсивности 180 Вт/м2, обозначен пунктирными линиями; облученного при интенсивности 840 Вт/м2 – сплошными линиями .

Таким образом, различия в амплитудах сигналов РСР невозможно объяснить только влиянием процессов темнового распада агрегатов и нужно искать другие причины .

Ранее в нашей лаборатории выполнимость закона взаимозаменяемости проверялась на моделях ФОП-гемолиза и ФОП-индуцированной супрессии реакции гиперчувствительности замедленного типа [46]. В обоих случаях закон не выполнялся. Причем ФОП-гемолизины образовывались лучше при высокой интенсивности, а ФОП-иммуносупрессоры – при низкой.

Для объяснения этих эффектов была предложена кинетическая схема реакций, представленная ниже:

Кинетическая схема реакций .

В схеме используются обозначения:

Пс – псорален;

А* – нестабильный промежуточный фотопродукт псоралена;

ФОП1 – продукт дальнейшей трансформации A*;

ФОП2 – продукт рекомбинации двух нестабильных промежуточных молекул A*;

k1, k2 – константы скорости реакций Как видно из реакции 0, при малой интенсивности УФА-облучения концентрация молекул А* будет малой, поэтому ФОП1 будет образовываться с большей вероятностью, чем ФОП2. Наоборот, при высокой интенсивности УФА-облучения концентрация молекул А* будет большой, поэтому ФОП2 будет образовываться с большей вероятностью, чем ФОП1 .

Таким образом, при повышении интенсивности облучения повышается эффективность образования фотопродуктов по реакции 2 (ФОП2), являющихся гемолизинами .

Полученные нами данные соответствуют указанной схеме .

3.1.10. Влияние интенсивности УФА-излучения на образование ФОПгемолизинов .

Параллельно с исследованием спектров РСР, были определены амплитуды и скорости гемолиза суспензии эритроцитов при добавлении в неё ФОП (рисунок 35) .

Как видно на рисунке 35, при добавлении в одинаковые пробы суспензии крови растворов псоралена, облученных на разных интенсивностях, но получивших приблизительно равную дозу облучения (~50 кДж/м2), амплитуда гемолиза одинакова (100 %) .

Рисунок 35. Зависимости амплитуды (1, 2) и скорости (3, 4) гемолиза от дозы облучения (365 нм) псоралена (0,1 мМ в ФБР) при облучении на интенсивностях 180 Вт/м2 (2, 4) и 840 Вт/м2 (1, 3) .

Однако в скоростях гемолиза наблюдается сильное различие: при облучении добавляемого псоралена на меньшей интенсивности (180 Вт/м2) наблюдается более резкое падение скорости гемолиза и дальнейшее её убывание (кривая 4 на рисунке 35) в отличие от случая с добавлением псоралена, облученного на большей интенсивности (840 Вт/м 2, кривая 3 на рисунке 35) .

Как можно объяснить данное различие? Одно из наиболее вероятных предположений звучит следующим образом: при более длительном облучении на меньшей интенсивности часть полученных агрегатов распадается, и поэтому скорость гемолиза падает быстрее, а также то, что при более длительном облучении происходит вторичное фотоокисление продуктов ФОП с последующим превращением продуктов-гемолизинов в продукты, не обладающие гемолитической активностью .

Резкое же падение скорости гемолиза при интенсивности облучения псоралена 180 Вт/м2 при дозе больше 100 кДж/м2 можно объяснить предположениями, что:

количество агрегатов упало по сравнению с количеством эритроцитов 1) настолько, что стало незначительным для процесса гемолиза;

в растворе ФОП присутствуют минимум два «типа» агрегатов, 2) отличающихся временем «жизни» и гемолитической активностью .

3.2. ИЗУЧЕНИЕ ИММУННЫХ МЕХАНИЗМОВ ОГРАНИЧЕНИЯ

РЕАКЦИИ КЧ ПРИ ДЕЙСТВИИ ФОП

3.2.1 Супрессорное действие ФОП на разные фазы развития реакции КЧ Известно, что развитие реакции КЧ протекает в две стадии – афферентной (сенсибилизации) и эффекторной (разрешения) [36]. На афферентной стадии реакции КЧ после аппликации гаптена происходит: 1) контакт и захват гаптена АПК кожи; 2) миграция связанных с гаптеном АПК в регионарные ЛУ; 3) представление АПК антигена наивным Т-лимфоцитам, что приводит к пролиферации, созреванию и миграции в ткани эффекторных лимфоцитов. Эффекторная стадия КЧ развивается после повторного контакта организма с АГ .

Ранее, в нашей лаборатории было показано, что пероральное введение мышам ФОП на эффекторной стадии реакции КЧ, а именно, за сутки до повторного нанесения гаптена (т.е. за сутки до разрешения реакции), вызывает ее супрессию [42]. Однако действие ФОП на афферентную фазу реакции КЧ изучено не было. В этой связи одной из задач настоящей работы было изучить действие ФОП на афферентную фазу развития реакции КЧ к ДНФБ у мышей .

Для решения поставленной задачи были поставлены следующие эксперименты. В первой серии опытов растворы ФОП вводили мышам перорально по 0,5 мл за 24 часа или через 24 часа (афферентная стадия), или 120 часов (эффекторная фаза) после сенсибилизации ДНФБ. Инициацию реакции КЧ к ДНФБ у мышей проводили согласно экспериментальному подходу, представленному в разделе материалы и методы. ФОП получали путем облучения (365 нм, 23 Вт/м2, 44 кДж/м2) 0,1 мМ раствора псоралена в ФБР, содержащим 1% этанола. Результаты экспериментов приведены на рисунках 36 и 37. На рисунке 36 видно, что ФОП вызывает супрессию КЧ независимо от времени его введения мышам: через 24 часа после сенсибилизации на 58±5% (p0,02), а через 120 часов – на 47±7% (p0,05) .

Однако, введение ФОП за 24 часа до аппликации гаптена (рисунок 37) не приводил к супрессии КЧ. Таким образом, в настоящей работе было показано, что, как эффекторная, так и афферентная фаза реакции КЧ чувствительны к супрессорному действию ФОП .

Согласно данным литературы [64] можно предположить, что супрессия КЧ при введении ФОП через 24 часа после сенсибилизации мышей ДНФБ могла быть следствием влияния данного агента на способность АПК представлять антиген наивным Т-лимфоцитам в регионарных ЛУ, а также на пролиферацию и созревание специфических Т-лимфоцитов. Отсутствие действия ФОП на реакцию КЧ при введении его за 24 часа до сенсибилизации могло быть следствием нескольких причин. Известно, что при приеме пациентом препарата псораленов в ходе проведения ПУВАтерапии они выводятся из организма пациента в течение суток [2; 86]. В этой связи можно предположить, что ФОП мог быть выведен из организма к моменту аппликации ДНФБ. Во-вторых, отсутствие действия ФОП при введении его мышам за 24 часа до сенсибилизации, могло свидетельствовать о том, что интактные иммунные клетки не были чувствительны к действию ФОП, или данный агент не влиял на процессы захвата антигена АПК кожи и последующую их миграцию в регионарные ЛУ .

Супрессорное действие ФОП на эффекторной стадии КЧ, т.е. при его введении за 24 часа до повторной аппликации гаптена, можно связать с прямым или опосредованным действием ФОП на функции эффекторных клеток [36] .

Таким образом, результаты полученных исследований указывают на существование нескольких иммунных механизмов ограничения реакции КЧ под действием ФОП .

Рисунок 36. ФОП вызывает супрессию реакции КЧ как на афферентной, так и на эффекторной стадиях ее развития. Необлученный псорален или ФОП вводили по 0,5 мл перорально через 24 или 120 часов после однократной сенсибилизации мышей ДНФБ. К+ (положительный контроль КЧ): сенсибилизированные ДНФБ мыши, получившие повторно аппликацию ДНФБ на ухо.

К- (отрицательный контроль КЧ):

интактные мыши, получившие аппликацию ДНФБ на ухо. Данные 5 независимых экспериментов SEM. *p0,02 по сравнению с К+; #p0,05 по сравнению с К+ Рисунок 37. Введение ФОП за 24 часа до инициации реакции КЧ не вызывает ее супрессию. ФОП вводили мышам перорально за 24 (ФОП -24) и спустя 24 (ФОП +24) часа с момента однократной сенсибилизации ДНФБ. К+ (положительный контроль КЧ):

сенсибилизированные ДНФБ мыши, получившие повторно аппликацию ДНФБ на ухо .

К- (отрицательный контроль КЧ): интактные мыши, получившие аппликацию ДНФБ на ухо. Данные 3 независимых экспериментов SEM. *p0,02 по сравнению с контролем 3.2.2 Действие ФОП на афферентную стадию реакции КЧ в зависимости от способа его введения Известно, что при проведении фотофереза УФА облучению подвергаются лейкоцитарная фракция крови пациента в присутствии псоралена [86]. Данное воздействие приводит к супрессии Т-клеточного иммунного ответа, в том числе и реакции КЧ [52]. В экспериментах, приведенных на рисунке 36, продукты фотоокисления псоралена вводили животным перорально, что приводило к супрессии реакции КЧ. Известно, что продукты фотоокисления псоралена высокореакционно-способны по отношению к биологическим молекулам [16]. В этой связи становится очевидным, что при пероральном или в/в введении ФОП первичные мишени с которыми будет реагировать ФОП должны различаться. Поэтому, осталось неясным, может ли ФОП вызывать супрессию реакции КЧ при его в/в введении. В настоящей работе была сравнена эффективность супрессорного действия ФОП при его пероральном и в/в введении .

Эти исследования проводили на афферентной фазе развития реакции КЧ (через 24 часа после сенсибилизации мышей ДНФБ). ФОП получали путем облучения (365 нм, 23 Вт/м2, 44 кДж/м2) раствора псоралена (0,1 мМ в ФБР + 1% этанола). Через 120 ч после сенсибилизации гаптен наносили на ухо животного. Через 24 часа регистрировали степень развития реакции КЧ .

Результаты экспериментов представлены на рисунке 38. Видно, что супрессия реакции КЧ не зависела от способа введения ФОП мышам. При в/в и пероральном введении супрессорное действие ФОП составляло 43%±5% и 44%±7% соответственно. С учетом изложенного, можно предположить, что при обоих способах введения, несмотря на различие, по-видимому, в первичных биологических мишенях при в/в и пероральном введении ФОП, его супрессорное действие на реакцию КЧ было сравнимым .

0.30 0.20

–  –  –

0.00 К- К+ в/в per os Рисунок 38. Супрессия реакции КЧ к ДНФБ не зависит от способа введения ФОП мышам. Мышам вводили перорально (per os) или внутривенно (в/в) по 0,5 мл ФОП через 24 часа после однократной сенсибилизации ДНФБ. К + (положительный контроль КЧ): сенсибилизированные ДНФБ мыши, получившие повторно аппликацию ДНФБ на ухо. К- (отрицательный контроль КЧ): интактные мыши, получившие аппликацию ДНФБ на ухо. Данные 5 независимых экспериментов SEM.*p0,001 по сравнению с К+. #p0,004 по сравнению с К+ .

3.2.3 Влияние ФОП на динамику накопления клеток в лимфоузлах и селезенках ДНФБ-сенсибилизированных мышей Известно, что ключевым этапом при развитии реакции КЧ является пролиферация, созревание и накопление пула специфических Т-лимфоцитов в ответ на накожную аппликацию гаптена [36]. Этот этап соответствует афферентной фазе развития КЧ. Т.к. ФОП угнетал реакцию КЧ на её афферентной стадии (рисунок 36), это указывало на возможность угнетения пролиферации АГ-специфических лимфоцитов при действии ФОП. В этой связи была поставлена задача изучить, как изменяется количество лимфоцитов в регионарных лимфоузлах и селезенках ДНФБсенсибилизированных мышей после введения ФОП. Для этого мышей сенсибилизировали путем аппликации на выбритую кожу брюшка 50 мкл 0,3% раствора ДНФБ в ацетоне. Затем, через 24, 96, 120 и 144 часа после сенсибилизации ДНФБ выделяли паховые лимфатические узлы и селезенки животных, готовили суспензии клеток и подсчитывали в камере Горяева абсолютное количество клеток, содержавшееся в выделенных органах. В опытных группах мышам вводили перорально по 0,5 мл раствора ФОП на разные сроки относительно сенсибилизации ДНФБ. В качестве отрицательного контроля (К-) была выбрана группа интактных мышей, у которых оценивали абсолютное количество клеток в лимфоузлах и селезенках .

На рисунке 39 видно, что абсолютное количество клеток в лимфоузлах сенсибилизированных мышей (положительный контроль, сплошная кривая, панели А, Б, В, Г) увеличивалось в 6 раз через 96 часов после сенсибилизации. На 6 и 7 сутки количество клеток снижалось. Увеличение абсолютного числа клеток лимфоузлов было обусловлено, согласно данным литературы [36], пролиферацией, дифференцировкой и созреванием в лимфатических узлах клона АГ-специфических Т лимфоцитов. Затем, через 120 часов после сенсибилизации, количество клеток в ЛУ снижалось, что, повидимому, было обусловлено миграцией лимфоцитов из лимфатических узлов в кровоток, а затем в ткани организма животного [18] .

На рисунке 40 видно, что максимум числа клеток селезенок мышей группы положительного контроля (сплошная кривая, панели А, Б, В, Г) достигался через 120 часов после сенсибилизации ДНФБ. Эти данные совпадали с данными, приведенными в литературе [47], и указывали на то, что увеличение абсолютного количества клеток селезенок могло быть следствием миграции в них АГ-специфических клеток из лимфоузлов [47] .

На рисунках 39 и 40 видно, что введение ФОП мышам как за 24 ч до (панели А), так и через 24 ч после (панели Б) сенсибилизации ДНФБ приводило к уменьшению накопления клеток в лимфоузлах и селезенках сенсибилизированных ДНФБ мышей. Эти данные указывают на то, что введение мышам ФОП могло приводить либо к угнетению пролиферации АГ-специфических Т-лимфоцитов, либо к индукции их апоптоза, как это описано для ПУВА-воздействия [51]. Нельзя исключить того, что уменьшение общего числа лейкоцитов в селезенке могло быть следствием стимуляции их миграции в ткани организма под действием ФОП .

–  –  –

Рисунок 39. Влияние ФОП на динамику изменения in vivo абсолютного числа клеток лимфоузлов ДНФБ-сенсибилизированных мышей .

Мышей сенсибилизировали накожно 50 мкл 0,3% ДНФБ. В течение 7 дней после сенсибилизации выделяли паховые лимфоузлы мышей и подсчитывали абсолютное количество клеток, содержавшееся в лимфоузлах. ФОП получали путем облучения (365 нм; 25 Вт/м2; 22,5 кДж/м2) раствора псоралена (0,1 мМ в ФБР + 1% этанола) .

Мышам вводили перорально по 0,5 мл ФОП за 24 часа до (панель А) или 24 часа (панель Б), 96 ч (панель В), 120 ч (панель Г) после сенсибилизации ДНФБ. Сплошная кривая: сенсибилизированные ДНФБ мыши (К+). Пунктирная кривая: мыши, получившие ФОП. К- (отрицательный контроль): интактные мыши. Данные 3-х независимых экспериментов SEM .

–  –  –

Г В

–  –  –

Рисунок 40. Влияние ФОП на динамику изменения in vivo абсолютного числа клеток селезенок ДНФБ-сенсибилизированных мышей. В течение 7 дней после сенсибилизации выделяли селезенки мышей без (сплошная кривая) и после (пунктирная кривая) введения ФОП и подсчитывали абсолютное количество клеток, содержавшееся в селезенках. Мышам вводили перорально по 0,5 мл ФОП за 24 часа до (панель А) или 24 часа (панель Б), 96 ч (панель В), 120 ч (панель Г) после сенсибилизации. Остальные условия проведения экспериментов аналогичны тем, как указанно в подписи к рис. 3. К- (отрицательный контроль): интактные мыши. Данные 3-х независимых экспериментов SEM .

–  –  –

сенсибилизированы ДНФБ на первые и вторые сутки. Через 24 и 44 часа спустя с момента первой сенсибилизации 0,5 мл ФОП или необлученного псоралена вводили мышам в/в или перорально. Через 72 часа с момента первичной аппликации ДНФБ получали суспензию клеток ЛУ, культивировали в течение 24 часов, и оценивали пролиферативную активность клеток. Как видно на рисунке 41, введение мышам необлученного псоралена не влияло на пролиферативную активность клеток ЛУ. При этом, как внутривенное, так и пероральное введение ФОП мышам приводило к достоверному снижению пролиферативной активности клеток ЛУ на 222,4% (p 0,03) и 164,9% (p 0,05), соответственно, по сравнению с контролем. Таким образом, введение ФОП мышам приводило к снижению пролиферативной активности клеток ЛУ .

Рисунок 41. Пролиферативная активность клеток ЛУ ДНФБсенсибилизированных мышей при введении им ФОП или необлученного псоралена внутривенно (заштрихованные столбцы) или перорально (сплошные столбцы). К+ – сенсибилизированные ДНФБ мыши. Псорален – мыши, получившие внутривенно или перорально необлученный псорален. ФОП или псорален вводили на 2ые и 3-ие сутки после двукратной сенсибилизации (1-ые и 2-ые сутки) мышей ДНФБ. *p 0,03 и #p 0,05 по сравнению с К+ .

3.2.5. Изменение цитокинового профиля клеток лимфоузлов под действием ФОП in vivo Известно, что супрессорное действие многих агентов на реакцию КЧ, включая ПУВА-воздействие, может быть следствием регуляции цитокинового профиля иммунокомпетентных клеток, принимающих участие в развитие КЧ [13; 19]. Поэтому, было изучено влияние ФОП in vivo на продукцию секреторных цитокинов клетками ЛУ ДНФБсенсибилизированных мышей .

Для этого, мыши были дважды сенсибилизированы ДНФБ на первые и вторые сутки. ФОП или необлученный псорален вводили мышам в/в или перорально на вторые (48 ч) и третьи (72 ч) сутки с момента первичной сенсибилизации. Через 72 часа с момента первичной аппликации ДНФБ получали суспензию клеток ЛУ. Суспензию клеток в полной среде культивировали в присутствии конканавалина А в течении 24 или 48 часов .

Продукцию цитокинов оценивали согласно протоколу, представленному в разделе 2.7 материалов и методов. Было обнаружено, что уровни ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-10, ГМ-КСФ и ФНО- в опытных группах мышей, получивших ФОП или псорален, достоверно не отличаются от таковых в контрольных группах .

Однако, введение ФОП ДНФБ-сенсибилизированным мышам приводило к достоверному уменьшению продукции таких цитокинов, как ИЛ-2, ИЛ-4 и ИФН- по сравнению с контрольной группой (К+) на 16,3%, 39,1%, 38% при его внутривенном введении (рисунок 42, заштрихованные столбцы) и на 40,8%, 53,7%, 51,6% при пероральном (рисунок 42, сплошные столбцы). На данном рисунке также видно, что продукция клетками ИЛ-17 под действием ФОП увеличивалась при его внутривенном введении на 33,3%, при пероральном – на 40,7% по сравнению с положительным контролем .

Необлученный псорален при этом не влиял на профиль цитокинов клеток лимфоузлов ДНФБ-сенсибилизированных мышей .

Рисунок 42. Уровень секреторных цитокинов клеток ЛУ ДНФБсенсибилизированных мышей. ФОП или псорален вводили мышам внутривенно (заштрихованные столбцы) или перорально (сплошные столбцы). К+ – ДНФБсенсибилизированные мыши. *p 0,05 и #p 0,03 по сравнению с К+ .

Представленные на рисунке 42 данные позволили заключить, что ФОП обладает модулирующим влиянием на продукцию секреторных цитокинов клетками ЛУ ДНФБ-сенсибилизированных мышей. Согласно данным литературы ИЛ-2 ответственен за стимуляцию пролиферации иммунокомпетентных T-клеток в реакции КЧ [18]. На рисунке 42 видно, что ФОП достоверно снижал продукцию ИЛ-2. По-видимому, антипролиферативная активность ФОП на афферентной фазе КЧ обусловлена угнетением продукции ИЛ-2 Т-лимфоцитами при действии данного агента .

Известно, что такие провоспалительные цитокины, как ИЛ-2, ИФН- и ИЛ-4 принимают участие в дифференцировке CD8+-клеток на афферентной фазе развития реакции КЧ [18]. На рисунке 42 видно, что ФОП уменьшает продукцию вышеупомянутых цитокинов, что может свидетельствовать о нарушении процесса дифференцировки CD8+ лимфоцитов в Тс1 и Тс2 субпопуляции под действием нашего агента [18]. Такое объяснение механизма супрессорного действия ФОП на афферентной фазе реакции КЧ представляется возможным, т.к., согласно данным литературы и собственным результатам (см. раздел 3.2.9), именно зрелые CD8+ лимфоциты являются эффекторными клетками КЧ, если в качестве гаптена был использован ДНФБ [36] .

Известно, что ИЛ-10 принимает участие в супрессии реакции КЧ индуцированной некоторыми агентами [77]. Тем не менее, в настоящих экспериментах по оценке влияния ФОП на цитокиновый профиль сенсибилизированных мышей уровень ИЛ-10 не изменялся. Данный факт говорит о том, что по-видимому, супрессия КЧ под действием ФОП не может протекать по ИЛ-10-зависимому механизму. В работе [29], посвященной изучению механизмов иммуносупрессорных свойств фотодинамической терапии с фотофрином на реакцию КЧ, было показано, что ИЛ-10 не участвует в подавлении данной реакции. Есть данные, что в роли супрессорного цитокина на реакцию КЧ может выступать ТФР-. А именно, Т-регуляторные клетки, экспрессирующие на своей поверхности ТФРмогут оказывать супрессорное действие на CD8+ эффекторы либо непосредственно через соответсвующие ТФР-рецепторы, либо нарушая функцию АПК [69]. В настоящей работе при изучении действия ФОП на цитокиновый профиль клеток ЛУ мышей ТФР- не регестрировали. Поэтому судить о роли ТФР- в реакции КЧ под действием ФОП не представляется возможным .

Интересным представляется факт, что введение ФОП мышам приводило к увеличению секреции провоспалительного цитокина ИЛ-17 (рисунок 42). Это может говорить о том, что ФОП вызывает переключение иммунного ответа, а именно: блокирует формирование Th1- и Th2-ответа, стимулируя образование Th17-лимфоцитов [27] .

3.2.6. Индукция апоптоза клеток ЛУ продуктами фотоокисления псоралена in vivo и in vitro В современной литературе уделяется много внимания индукции апоптоза иммунокомпетентных клеток, как одному из основных механизмов иммуносупрессорного действия ПУВА-терапии и фотофереза при различных патологиях, обусловленных гиперреактивностью Т-клеток [52]. Выявленное в разделе 3.2.3 настоящей работы снижение клеток ЛУ ДНФБсенсибилизированных мышей под действием ФОП могло быть следствием индукции апоптоза лимфоцитов принимающих участие в развитии реакции КЧ под действием нашего агента. На такую возможность указывает и работа Caffieri et al [16], где было показано, что добавление ФОП, полученного при облучении очень концентрированного раствора псоралена (2,7 мМ), к культуре опухолевых Т-клеток линии вызывает генерацию Jurkat, апоптотических клеток. Исходя из этого, возникает вопрос: способен ли ФОП индуцировать апоптоз Т-лимфоцитов участвующих в реакции КЧ. В этой связи в настоящей работе было изучено влияние проапоптогенного действия ФОП на клетки лимфоузлов ДНФБ-сенсибилизированных мышей in vivo и in vitro .

Выявление апоптоза in vivo при действии ФОП В данном разделе была изучена возможность индукции in vivo позднего апоптоза клеток лимфоузлов сенсибилизированных ДНФБ мышей, получивших ФОП. ФОП (48 кДж/м2) вводили мышам перорально по 0,5 мл через 24 часа после сенсибилизации последних ДНФБ. Через 24 и 72 часа после введения ФОП (48 и 96 ч после сенсибилизации соответственно) выделяли клетки паховых лимфатических узлов, суспензии клеток отмывали в ФБР и инкубировали в красящем растворе, содержащем пропидиум йодид, как описано в главе Материалы и методы. Образцы клеток анализировали методом однолучевой проточной цитофлуорометрии. Параллельно с оценкой проапоптотической активности ФОП оценивали его действие на реакцию КЧ .

В данных экспериментах пероральное введение ФОП через 24 ч после сенсибилизации приводило к супрессии реакции КЧ на 45%±7% (p0,05 по сравнению с положительным контролем), данные не приведены. На рисунках 43 и 44 приведено распределение флуоресцирующих клеток лимфоузлов мышей в группах отрицательного контроля (43А, К-: интактные мыши), положительного контроля (43Б, К+: ДНФБ-сенсибилизированные мыши) и ДНФБ-сенсибилизированных мышей получивших ФОП (рисунок 44). На приведенных диаграммах (справа) буквами A, C и D обозначены пики субдиплоидных, диплоидных и тетраплоидных клеток соответственно .

Цифрами на этих диаграммах указано количество данных типов клеток в процентах. Видно, что во всех исследованных группах (K-, K+, ФОП) субдиплоидный пик не проявляется, независимо от того, на какие сроки оценивалась плоидность клеток (48 или 96 ч). Эксперимент был воспроизведен двукратно, однако во втором опыте также не было выявлено увеличение процента апоптотирующих лимфоцитов после введения ФОП ДНФБ-сенсибилизированным мышам. Согласно данным литературы, метод оценки апоптоза с применением йодистого пропидия позволяет выявить только поздний апоптоз клеток [7]. Таким образом, можно заключить, что использование методики оценки позднего апоптоза с йодистым пропидием цитофлуориметрическим методом, а также схема проведения экспериментов, не позволила обнаружить проявления апоптотической активности ФОП in vivo в лимфоузлах ДНФБ-сенсибилизированных мышей .

Рисунок 43. Распределение флуоресценции клеток лимфоузлов мышей в группах отрицательного (А) и положительного (Б) контролей. А) К- - интактные мыши, Б) К+ сенсибилизированные мыши. Плоидность клеток лимфоузлов мышей, оценивали через 48 и 96 ч после сенсибилизации ДНФБ. Латинские буквы A,C и D на диаграммах – пики субдиплоидных, диплоидных и тетраплоидных клеток соответственно .

Рисунок 44. Распределение флуоресцирующих клеток лимфоузлов мышей получивших ФОП. ФОП получали путем предоблучения (I=45 Вт/м2, 94 кДж/м2) 0,14 мМ раствора псоралена в ФБР с 1% этанола.500 мкл ФОП вводили перорально мышам через 24 ч после сенсибилизации ДНФБ. Плоидность клеток лимфоузлов мышей, оценивали через 48 и 96 ч после сенсибилизации ДНФБ. Латинские буквы A,C и D на диаграммах – пики субдиплоидных, диплоидных и тетраплоидных клеток соответственно .

Выявление апоптоза in vitro при действии ФОП Проапоптотическое действие ФОП на клетки ЛУ мышей выделенных спустя 24 или 72 часа после их сенсибилизации Как было показано в предыдущем разделе, использование метода регистрации апоптоза с применением пропидия йодида в качестве красителя не позволило выявить апоптотического действия ФОП in vivo на клетки ЛУ ДНФБ-сенсибилизированных мышей. Однако, согласно данным литературы, продукты фотоокисления псоралена способны вызывать апоптоз лейкоцитов in vitro [16]. При этом данные результаты были получены путем регистрации апоптоза с использованием двойного окрашивания клеток аннексином VФИТЦ и йодистым пропидием (An/Pi). Вышеупомянутый метод регистрации апоптоза позволяет выявлять как ранний, так и поздний апоптоз клеток [7]. В этой связи было изучено проапоптотическое действие ФОП in vitro методом An/Pi-регистрации. В настоящей работе было изучено действие ФОП in vitro на индукцию апоптоза клеток ЛУ, полученных в разные сроки (24 или 72 часа) после сенсибилизации мышей ДНФБ .

Для этого, в суспензию клеток ЛУ в ФБР, выделенных спустя 24 (рисунок 45) или 72 часа (рисунок 46) после сенсибилизации мышей ДНФБ, добавляли ФОП таким образом, чтобы конечная концентрация по псоралену до его облучения составляла 10-6М, 10-5М или 5х10-5 М. Концентрация необлученного псоралена в суспензии клеток всегда составляла 5х10 -5 М .

Доза облучения раствора псоралена составляла 13,4 кДж/м2, интенсивность 21 Вт/м2.Регистрацию апоптоза производили спустя 4 и 18 часов культивации клеток ЛУ. Процент апоптотических клеток определяли путем суммирования An-положительных (An+Pi-, ранний апоптоз) и AnPi-положительных (An+Pi+, поздний апоптоз) клеток (событий) в каждой группе и последующего их сравнения с группой положительного контроля. Разность между пробами положительного контроля (клетки ЛУ от ДНФБ-сенсибилизированных мышей, полученные через 24 или 72 часа после аппликации гаптена, К+) и опытными пробами расценивали как процент апоптотических клеток в последних. На рисунках 45 и 46 видно, что процент апоптотических клеток, полученных через 24 или 72 часа после сенсибилизации мышей ДНФБ, и инкубированных в присутствии необлученного псоралена не отличался от положительного контроля как через 4, так и 18 часов спустя культивации последних. Добавление ФОП in vitro в концентрации 10-6М к суспензиям клеток ЛУ мышей полученных через 24 или 72 часа после сенсибилизации животных ДНФБ также не вызывал прирост апоптотических клеток по сравнению с положительным контролем .

Рисунок 45. Влияние ФОП in vitro на процент апоптотических клеток ЛУ, выделенных спустя 24 часа после сенсибилизации мышей ДНФБ .

Клетки ЛУ, полученные через 24 часа после сенсибилизации мышей ДНФБ, инкубировали в присутствии ФОП или необлученного псоралена (Пс) в течение 4 или 18 часов. Затем регистрировали апоптоз. Конечные концентрации по псоралену в пробах составляли 10-6, 10-5 или 5х10-5 М. К+ – клетки ЛУ ДНФБ сенсибилизированных мышей .

An+ - ранний апоптоз, An+PI+ поздний апоптоз, PI+ - некроз. *p0,05 и #p 0,03 по сравнению с K+ .

Однако, ФОП in vitro в концентрациях 10-5 М и 5х10-5 М вызывал увеличение процента апоптотических клеток ЛУ, полученных через 24 часа после сенсибилизации мышей ДНФБ: на 6% и 17% после 4 часов культивации (p0,05 и p0,03), и на 2,5% и 15% после 18 часов соответственно (p0,05 и p0,03). Добавление ФОП in vitro к суспензии клеток ЛУ полученных спустя 72 часа после сенсибилизации мышей ДНФБ (рисунок 46) в тех же концентрациях (10-5 М и 5х10-5 М) также достоверно увеличивал процент апоптотических клеток: на 4% и 11% после 4 часов культивации (p0,05 и p0,03), и на 8% и 15 % после 18 часов соответственно (p0,05 и p0,03) .

Известно, что спустя 24 часа после сенсибилизации в ЛУ происходит представление АГ АПК наивным Т-лимфоцитам, и начало пролиферации Тклеток. Время в 72 часа после нанесения гаптена на кожу животного, соответствует пику пролиферации и накопления Т-клеток в ЛУ. Кроме того, на данном этапе в лимфатических узлах происходит накопление и наблюдается максимум пролиферации NK и B-клеток [47]. Таким образом, очевидно, что в регионарных ЛУ сенсибилизированных животных через 24 и 72 часа находятся разные субпопуляции клеток, принимающих участие в развитии КЧ. Тем не менее, процент апоптотических клеток в ЛУ под действием ФОП in vitro как через 24, так и 72 часа спустя сенсибилизации был сопоставим .

Рисунок 46. Влияние ФОП in vitro на процент апоптотических клеток ЛУ, выделенных спустя 72 часа после сенсибилизации мышей ДНФБ .

Клетки ЛУ, полученные через 72 часа после сенсибилизации мышей ДНФБ, инкубировали в присутствии ФОП или необлученного псоралена (Пс) в течение 4 или 18 часов. Затем регистрировали апоптоз. Конечные концентрации по псоралену в пробах составляли 10-6, 10-5 или 5х10-5 М. К+ – клетки ЛУ ДНФБ сенсибилизированных мышей .

An+ - ранний апоптоз, An+PI+ поздний апоптоз, PI+ - некроз. *p0,05 и #p 0,03 по сравнению с K+ .

Проапоптотическое действие ФОП на клетки ЛУ интактных мышей В настоящем разделе нами было изучено апоптотическое действие ФОП in vitro на лимфоциты несенсибилизированных (интактных) животных .

Схема эксперимента выглядела так же, как указано в предыдущем разделе, за исключением того, что клетки ЛУ выделяли из интактных животных .

Соответственно, контролем служили клетки ЛУ интактных мышей, к которым добавляли ФБР с 1% этанола. На рисунке 47 видно, что процент апоптотических клеток ЛУ интактных мышей инкубированных в присутствии необлученного псоралена Рисунок 47. Влияние ФОП in vitro на процент апоптотических клеток ЛУ интактных мышей .

Клетки ЛУ интактных мышей, инкубировали в присутствии ФОП или необлученного псоралена (Пс) в течение 4 или 18 часов. Затем регистрировали апоптоз. Конечные концентрации по псоралену в пробах составляли 10-6, 10-5 или 5х10-5 М. К+ – клетки ЛУ ДНФБ сенсибилизированных мышей. An+ - ранний апоптоз, An+PI+ поздний апоптоз, PI+ некроз. *p0,05 и #p 0,03 по сравнению с K- .

не отличался от положительного контроля через 4 и 18 часов спустя культивации последних. Добавление ФОП in vitro в концентрации 10-6М к суспензиям клеток ЛУ мышей также не вызывал прирост апоптотических клеток по сравнению с положительным контролем .

Было показано, что ФОП in vitro в концентрациях 10-5 М и 5х10-5 М вызывал увеличение процента апоптотических клеток ЛУ интактных животных на 7% и 21% после 4 часов культивации (p0,05 и p0,03), и на 14% и 31% после 18 часов соответственно (p0,05 и p0,03) .

Как видно из рисунков 45, 46 и 47 при действии ФОП in vitro процент апоптоза клеток ЛУ интактных мышей превышает процент апоптозирующих клеток ЛУ ДНФБ-сенсибилизированных мышей выделенных как через 24 так и 72 часа после аппликации гаптена .

Известно, что во время пролиферации клеток, принимающих участие в реакции КЧ происходит увеличение синтеза ИЛ-2, который обладает антиапоптогенными свойствами [36]. Данный факт, возможно, служит объяснением тому, что интактные клетки более чувствительны к апоптогенному действию ФОП, нежели пролиферирующие клетки, полученные от сенсибилизированных животных. Кроме того, как уже было указано выше, процент апоптозирующих клеток ЛУ сенсибилизированных мышей под действием ФОП не отличался между собой в зависимости от времени выделения клеток (спустя 24 или 72 часа). Анализируя полученные результаты можно заключить, что, по-видимому, выявленное проапоптотическое действие ФОП не может вносить вклад в его супрессорное действие на реакцию КЧ в отличие от фотофереза [86] .

3.2.7. Выполнимость закона Бунзена-Роско для проапоптотического действия ФОП на клетки лимфоузлов интактных мышей Известно, что продукты фотоокисления псоралена, обладающие супрессорным действием на реакцию КЧ или ГЗТ, образуются лучше при низких интенсивностях действующего УФА-света, а продукты, обладающие мембранотоксическими свойствами – при более высоких [46]. Также было показано, что при облучении раствора псоралена в нем образуются продукты фотоокисления, способные к индукции апоптоза [16]. Однако, физические условия их образования, а именно, зависимость от интенсивности действующего света изучены не были. В настоящем разделе была изучена выполнимость закона взаимозаменяемости интенсивности света и длительности облучения растворов псоралена (закон Бунзена-Роско), добавляемого в темноте к клеткам лимфоузлов интактных мышей для изучения проапоптогенного действия ФОП .

В предыдущем разделе было показано, что ФОП способен оказывать проапоптотическое действие на клетки лимфоузлов как интактных, так и ДНФБ-сенсибилизированных мышей. Процент апоптоза интактных клеток, индуцированных под действием ФОП, был в два раза выше, чем для клеток сенсибилизированных животных (рисунки 47 и 45). Таким образом, для дальнейших экспериментов были выбраны клетки ЛУ интактных животных .

Результаты экспериментов и описание условий опытов приведены на рисунке 48 и в подписи к нему .

Рисунок 48. Влияние интенсивности действующего УФА-света на образование проапоптогенных продуктов ФОП .

Раствор псоралена (0,1 мМ, 1% этанола) облучали при одинаковых дозах, но разных интенсивностях (40 Вт/м2 и 190 Вт/м2). Дозы облучения составляли: 0 кДж/м2 (необлученный псорален), 5,8 кДж/м2, 8,8 кДж/м2, 11,7 кДж/м2 и 14,7 кДж/м2. Далее 1 мл раствора ФОП добавляли in vitro к 1 мл клеточной суспензии, содержащей 3х106 клеток .

Спустя 4 и 18 часов культивации оценивали апоптоз цитофлюориметрическим методом используя An/Pi-окрашивание. Каждая точка на кривых представляет собой среднее значение ± SEM, полученное на группе из 3-х животных .

На рисунке 48 видно, что количество клеток ЛУ интактных мышей (К-), вступивших в апоптоз, возрастает с увеличением времени инкубации от 4 до 18 часов. Видно, что необлученный псорален не способен влиять на количество вступивших в апоптоз клеток. При низкой интенсивности действующего света (40 Вт/м2) процент апоптотических клеток монотонно растет с увеличением дозы облучения. Наиболее заметный рост кривой наблюдается после дозы облучения псоралена в 5,8 кДж/м2. После четырех часов культивации процент вступивших в апоптоз клеток при максимальной дозе облучения (14,7 кДж/м2) превышал значение отрицательного контроля на 19%, а после 18 часов на 23%. Дозовые кривые, полученные при высокой интенсивности (190 Вт/м2) действующего УФА-света носили качественно другой характер. На начальном участке дозовых кривых апоптотический эффект ФОП был значительно сильнее при высокой интенсивности чем при низкой (40 Вт/м2). Процент апоптоза при высокой интенсивности быстро достигал максимума и выходил на плато (8,8 и 11,7 7 кДж/м2), а затем снижался и становился таким же, как и при малой интенсивности УФА (40 Вт/м2). После четырех часов культивации процент вступивших в апоптоз клеток при дозе облучения в 8,8 кДж/м2 превышал значение отрицательного контроля на 30%, а после 18 часов на 33% .

Таким образом, можно сделать вывод, что образование продуктов фотоокисления псоралена, вызывающих апоптоз, зависит от интенсивности действующего света. Причем, уменьшение интенсивности света приводит к уменьшению выхода таких продуктов фотоокисления псоралена, что говорит о невыполнимости закона взаимозаменяемости .

Поведение рассматриваемых здесь дозовых кривых имеет некоторые параллели с характером повреждения мембран эритроцитов под действием ФОП, продемонстрированное ранее в нашей лаборатории с помощью модели гемолиза [5]. Было показано, что эффективность образования ФОПгемолизинов снижается с уменьшением интенсивности облучения псоралена .

Похожий эффект наблюдается и при ФОП-индуцированном апоптозе клеток ЛУ интактных мышей (рисунок 48) в дозах до 11,7 кДж/м2, причем независимо от времени культивации клеток. Особый интерес представляет собой поведение дозовых кривых эффективности ФОП-апоптоза при высоких интенсивностях действующего света. Дело в том, что подобные зависимости были получены и при высокоинтенсивном (180 Вт/м 2) ФОПгемолизе, а именно: существовала пороговая доза облучения, ниже которой гемолиза не происходило, т.е. мембраны эритроцитов не повреждались. При превышении данной пороговой дозы наблюдалась быстрая гибель клеток, однако при дальнейшем увеличении дозы облучения псоралена скорость лизиса эритроцитов парадоксальным образом начинала снижаться .

Объяснение этому парадоксу возникло на основании сравнения ФОПгемолиза и гемолиза, индуцированного ионолом [10]. Было показано, что существует пороговая концентрация ионола (2х10-5М), ниже которой гемолиз не происходит. При небольшом превышении пороговой концентрации ионол вызывал очень быстрый лизис эритроцитов. Однако, при дальнейшем увеличении концентрации ионола скорость гемолиза начинает снижаться .

Турбидиметрическим методом было показано, что, начиная с пороговой концентрации, происходит агрегация ионола и увеличение мутности растворов. Эффективный гемолиз вызывали только мелкие кристаллы .

Исходя из этого, было предположено, что аналогичный механизм ответственен и за ФОП-гемолиз, т.е. при облучении псоралена образуются агрегаты из продуктов его фотоокисления, причем быстрее всего эритроциты повреждаются небольшими ФОП-агрегатами, а по мере их роста с дозой облучения эффект снижается. Однако в предыдущих работах не удавалось обнаружить агрегацию ФОП. В настоящей работе, благодаря использованию метода РСР, это сделать удалось. В пользу приведенной выше гипотезы говорят и полученные в разделе 3.1 настоящей работы данные по фотоиндуцированной агрегации псоралена. Представляется возможным предположить, что в случае ФОП-индуцированного апоптоза могли быть задействованы аналогичные механизмы, особенно в случае высокоинтенсивного ФОП-апоптоза .

3.2.8 Образование агрегатов продуктов ФОП при дозах, вызывающих апоптоз клеток лимфоузлов мышей .

В разделе 3.1 методом РСР было показано, что облучение псоралена ведет к появлению агрегатов продуктов в растворе ФОП. Исходя из этого, в настоящем разделе была поставлена задача изучить, каким образом степень агрегатообразования влияет на апоптогенное действие ФОП. Для этого, раствор псоралена (0,1 мМ, 1% этанола) облучали при одинаковых дозах, но разных интенсивностях (40 Вт/м2 и 190 Вт/м2). Дозы облучения и интенсивности УФА-света были выбраны аналогичным, приведенным в предыдущем разделе, а именно: 0 кДж/м2 (необлученный псорален), 5,8 кДж/м2, 8,8 кДж/м2, 11,7 кДж/м2 и 14,7 кДж/м2. После облучения растворов облученного псоралена производили регистрацию спектров поглощения и РСР. Результаты экспериментов приведены на рисунке 51 .

–  –  –

Рисунок 49. Спектры поглощения необлученного псоралена и ФОП, облученных при дозе 11,7 кДж/м2 и интенсивностях 40 и 190 Вт/м2 .

На рисунке 49 видно, что спектры поглощения растворов ФОП, облученных при дозе 11,7 кДж/м2 и интенсивностях 40 и 190 Вт/м2 совпадают, т.е. фотовыцветание псоралена не зависит от интенсивности и методом спектрофотометрии какие-либо отклонения от закона Бунзена-Роско не наблюдаются. При данной дозе облучения ФОП обладает высокой проапоптогенной активностью на клетки ЛУ интактных мышей .

Рисунок 50. Спектры РСР ФОП при разных дозах облучения и двух интенсивностях (40 и 190 Вт/м2). Стрелками указано возрастание сигнала РСР, цифрами рядом с ними – дозы облучения раствора псоралена .

Однако отклонения от закона взаимозаменяемости отчетливо выявляются при использовании метода РСР. Из рисунка 50 видно, что при высокой интенсивности (190 Вт/м2) агрегация происходит существенно эффективнее, чем при низкой (40 Вт/м2) .

На рисунке 51 показаны дозовые зависимости величины сигнала РСР ФОП-раствора при 290 нм для интенсивностей 40 и 190 Вт/м 2. Как видно из рисунка 51, значения РСР при большей интенсивности действующего света возрастают быстрее, нежели чем при меньшей интенсивности. Как уже было указано выше, проапоптогенный эффект ФОП также возрастал быстрее при большей интенсивности действующего света .

Рисунок 51. Зависимости величин сигнала РСР раствора ФОП измеренного при 290 нм от доз облучения при двух интенсивностях – 40 и 190 Вт/м2 .

Таким образом, анализируя дозовые кривые ФОП-апоптоза (рисунок

48) и ФОП-агрегации (рисунок 51) представляется возможным предполагать, что проапоптотический эффект ФОП при низкой и высокой интенсивностях действующего УФА-света имеет разный механизм. Более того, сходство поведения дозовых кривых для ФОП-апоптоза и ФОП-агрегации дает возможным предполагать участие явления агрегации продуктов фотоокисления псоралена в его проапоптотическом действии на клетки ЛУ интактных мышей при высокой интенсивности УФА-излучения .

По данным литературы известно, что продукты ФОП можно подразделить на два класса: 1) обладающие иммуномодулирующими свойствами в т.ч. в реакциях КЧ и ГЗТ, и 2) продукты, вызывающие гемолиз эритроцитов, т.е. проявляющие мембранотоксические эффекты [5]. Кроме того, известно, что продукты первого типа в основном образуются при малых интенсивностях действующего света (например, при 40 Вт/м2), тогда как ФОП-гемолизины – при высоких (более 150 Вт/м2). На рисунке 48 видно, что увеличение интенсивности света приводит к увеличению проапоптогенного эффекта ФОП. Анализируя полученные результаты и сопоставляя их с вышеизложенными данными литературы можно предположить, что повидимому: 1) проапоптотическая активность продуктов ФОП определяется интенсивностью действующего света при их получении 2) проапоптогенное действие ФОП вряд ли может считаться главным механизмом иммуносупрессорного действия нашего агента, особенно в условиях высокоинтенсивного облучения .

3.2.9. Выявление субпопуляции Т-лимфоцитов, ответственной за развитие реакции КЧ к ДНФБ Известно, что развитие реакции КЧ может быть опосредовано CD4+ или CD8+ лимфоцитами [18]. При этом тип эффекторных клеток, ответственных за реакцию КЧ зависит от вида гаптена, генетических особенностей сенсибилизируемого организма и линии мышей [36]. В разделе 3.2.3 настоящей работы было показано, что сенсибилизация мышей ДНФБ приводит к увеличению количества клеток ЛУ (рисунок 39, К+). Прирост количества клеток ЛУ происходил в течение 96 часов после сенсибилизации ДНФБ, что согласно данным литературы [47], указывало на формирование клеток-эффекторов реакции КЧ. Для выявления клеточной популяции, ответственной за развитие КЧ к ДНФБ, были проведены эксперименты по

–  –  –

Мышей-доноров сенсибилизировали ДНФБ. Через 144 часа выделяли спленоциты. Из суспензии спленоцитов методом негативной иммуномагнитной сепарации, выделяли CD3+, CD4+ или CD8+ субпопуляции Т-лимфоцитов. Интактным сингенным мышам-реципиентам переносили в/в по 4106 клеток CD3+, CD4+ или CD8+ лимфоцитов. Через 1 час после переноса клеточной суспензии мышам-реципиентам наносили разрешающую дозу ДНФБ на ухо. Еще через 24 часа регистрировали интенсивность реакции

КЧ. Были поставлены следующие контроли реакции КЧ:

А) К- (отрицательный контроль): интактные мыши, получившие только аппликацию ДНФБ на ухо;

Б) К++ (положительный контроль реакции КЧ в переносе): интактным реципиентам в/в вводили суммарную клеточную фракцию спленоцитов, полученных от сенсибилизированных доноров (2х10 7 клеток на мышь), затем на ухо наносили разрешающую дозу ДНФБ;

Рисунок 53. Выявление клеток-эффекторов реакции КЧ к ДНФБ .

К- – отрицательный контроль;

К++ – положительный контроль реакции КЧ в переносе;

Интактным сингенным мышам-реципиентам переносили в/в популяции CD3+, CD4+ или CD8+ лимфоцитов. Через 1 час после переноса мышам-реципиентам наносили разрешающую дозу ДНФБ на ухо. Еще через 24 часа регистрировали интенсивность реакции КЧ .

#p0,05 по сравнению с К++ На рисунке 53 видно, что перенос суммарной фракции спленоцитов от ДНФБ-сенсибилизированных доноров интактным мышам-реципиентам, приводил к сенсибилизации, что проявлялось в развитии у последних реакции КЧ при аппликации ДНФБ на ухо (группа К++). У мышей данной группы отек уха составлял 0,14±0,03 мм. Перенос популяций CD3+ или CD8+ лимфоцитов также приводил к развитию реакции КЧ у интактных мышей-реципиентов. Выраженность реакции КЧ для групп CD3+ (0,11±0,02мм) и CD8+ (0,12±0,02мм) статистически не отличалась от группы положительного контроля К++. Перенос CD4+ лимфоцитов также приводил к развитию реакции КЧ, однако интенсивность данной реакции составляла всего 3±1.1% (0,038±0,009 мм) и была достоверно (p0,05) ниже по сравнению с таковой в группе положительного контроля. Данный факт свидетельствует о том, что в условиях экспериментов, представленных в настоящей работе, АГ-специфические CD4+ лимфоциты не способны в достаточной степени переносить реакцию КЧ, тогда как CD8+ субпопуляция Т-лимфоцитов проявляет свойства клеток-эффекторов КЧ .

3.2.10. Выявление специфичности супрессорного действия ФОП при его внутривенном введении мышам Известно, что супрессия КЧ, обусловленная действием фотофереза, является специфической и может быть следствием генерации Трегуляторных клеток [28]. В нашей лаборатории ранее было показано, что пероральное введение мышам ФОП приводит к появлению в селезенках животных клеток со специфическим супрессорным действием на КЧ [5]. Эти данные указывали на сходство в иммунологических механизмах супрессорного действия ФОП и фотофереза. Однако, при проведении фотофереза УФА-облучению в присутствии псораленов подвергаются лейкоциты пациента. В экспериментах, приведенных в работе [5] растворы УФА-предоблученных псораленов вводили животным перорально. Вполне очевидно, что первичные иммунные мишени при пероральном и в/в введении препарата должны различаться. В связи с вышеизложенным осталось не ясным, способен ли ФОП оказывать специфическое супрессорное действие на КЧ при его в/в введении животным .

Для выяснения иммуноспецифичности супрессорного действия ФОП при его внутривенном введении были проведены опыты по адоптивному переносу супрессии реакции КЧ к двум разным гаптенам – ДНФБ и оксазолону (ОХА). Схема эксперимента представлена на рисунке 54 .

В разделе 3.2.9 настоящей работы было показано, что в условиях наших экспериментов реакция КЧ к ДНФБ опосредуется CD8+ лимфоцитами. Согласно данным литературы развитие реакции КЧ к оксазолону, напротив, опосредуется СD4+ Th1 Т-лимфоцитами [21; 32]. В этой связи, гаптены ОХА и ДНФБ являются неперекрестными, и могут быть использованы для выявления иммуноспецифичности .

–  –  –

Как видно на рисунке 54, мышей-доноров сенсибилизировали 50 мкл 0,3% ДНФБ на кожу выбритого брюшка. Через 24 или 120 часов после сенсибилизации им вводили в/в по 0,5 мл необлученного псоралена в ФБР, содержащим 1 % этанола, или ФОП.

Через 120 или 24 часа после введения псоралена или ФОП из мышей доноров выделяли суспензию спленоцитов, которую внутривенно вводили по 106 клеток на мышь двум сериям реципиентов:

А) Мышам-реципиентам, предварительно за 6 дней сенсибилизированным 50 мкл 0,3% ДНФБ;

Б) Мышам реципиентам, предварительно за 6 дней сенсибилизированным оксазолоном (50 мкл, 2%-ый спиртовой раствор) .

Далее, через 1 час после введения спленоцитов мышам-реципиентам, им были нанесены разрешающие количества соответствующих гаптенов: 5 мкл 0,2% ДНФБ или 5 мкл 0,4% оксазолона, соответственно. Гаптены наносили на одно из ушей каждой мыши, на второе ухо наносили ацетон. Через 24 часа производили регистрацию интенсивности КЧ.

Были поставлены следующие контроли реакции КЧ:

К+ (положительный контроль реакции КЧ к гаптену без переноса спленоцитов): мышей-реципиентов сенсибилизировали ДНФБ или OXA;

разрешение реакции проводили соответствующим гаптеном;

К++ (положительный контроль реакции КЧ в переносе): реципиенты были сенсибилизированы либо ДНФБ, либо ОХА. После введения им спленоцитов доноров на ухо наносили разрешающую дозу соответствующего (того же что и при сенсибилизации) гаптена;

К- (отрицательный контроль): интактные мыши, получившие только аппликацию ДНФБ или ОХА на ухо;

К-1 (отрицательный контроль на перекрестность гаптенов): интактным мышам-реципиентам переносили спленоциты от ДНФБсенсибилизированных доноров. Для разрешения реакции КЧ использовали ОХА;

Результаты экспериментов представлены на рисунке 55 .

На рисунке 55 видно, что перенос клеток от ДНФБсенсибилизированных доноров, к ДНФБ-сенсибилизированным реципиентам (группа К++), не приводил к увеличению КЧ (группа К++) по сравнению с положительным контролем на ДНФБ без адоптивного переноса клеток (группа К+). Это свидетельствует о том, гаптен-специфические эффекторные лимфоциты доноров не вносили вклад в реакцию КЧ реципиентов .

Рисунок 55. ФОП обладает специфическим супрессорным действием на КЧ при его в/в введении мышам .

Мышам-донорам вводили внутривенно по 0,5 мл необлученного псоралена (Пс, 0,2 мМ в ФБР с 1% этанола) или фотоокисленного псоралена (ФОП) через 24 или 120 часов после сенсибилизации животных ДНФБ. Через 24 часа выделяли спленоциты и переносили их внутривенно мышам-реципиентам. Схема проведения экспериментов приведена на рис. 54 .

А) ДНФБ: мыши-реципиенты были сенсибилизированы ДНФБ .

К++ (положительный контроль на ДНФБ в переносе) – перенос спленоцитов от ДНФБсенсибилизированных мышей-доноров, получивших вместо ФОП 0,5 мл ФБР с 1% этанола, сенсибилизированным ДНФБ мышам-реципиентам .

К- (отрицательный контроль на ДНФБ) – интактные мыши, получившие только аппликацию ДНФБ на ухо .

Б) Оксазолон: мыши-реципиенты были сенсибилизированы оксазолоном .

К++ (положительный контроль на оксазолон в переносе) - перенос спленоцитов от ДНФБ-сенсибилизированных мышей-доноров, получивших вместо ФОП ФБР в том же объеме, мышам-реципиентам, сенсибилизированным оксазолоном .

К1- (отрицательный контроль на перекрестность гаптенов) перенос спленоцитов от ДНФБ-сенсибилизированных мышей-доноров, интактным мышам-реципиентам с последующим их тестированием оксазолоном на ухо .

К- и К+ – отрицательный и положительный контроли к соответствующему гаптену без переноса спленоцитов, соответственно Каждая из групп состояла из 5 пар сингенных мышей-доноров и мышей-реципиентов .

Представлено среднее ± SEM. *p0,001 и #p0,02 по сравнению с соответствующим К++ .

Видно также, что в/в введение необлученного псоралена мышамдонорам, не влияло на реакцию КЧ как ДНФБ, так и ОХАсенсибилизированных реципиентов. Напротив, перенос клеток от доноров, получивших ФОП в/в, ДНФБ-сенсибилизированным реципиентам подавлял реакцию КЧ на 90%±6% (p0,001 по сравнению с группой К++). Видно также, что перенос клеток от ДНФБ-сенсибилизированных доноров, к реципиентам, сенсибилизированным оксазолоном не приводил к увеличению КЧ (К ++). Это свидетельствует о том, что ДНФБ-специфические лимфоциты не вносили вклад в реакцию КЧ к оксазолону. Перенос спленоцитов от ДНФБ сенсибилизированных доноров интактным мышам реципиентам, которые затем были сенсибилизированы оксазолоном (группа К-1) не приводил к развитию КЧ реципиентов. Эти данные доказывают, что ДНФБ и оксазолон не являются перекрестными гаптенами. Видно, что перенос клеток от ДНФБсенсибилизированных доноров, получивших ФОП в/в, сенсибилизированным оксазолоном реципиентам приводил к увеличению реакции КЧ на 41%±5% .

(p0,02 по сравнению с соответствующим К++) .

Таким образом, показано, что в/в инъекция ФОП мышам-донорам приводила к появлению в селезенках животных клеток, которые: а) вызывали супрессию КЧ у мышей-реципиентов, сенсибилизированных ДНФБ; б) активацию КЧ у мышей-реципиентов, сенсибилизированных оксазолоном .

Результаты, представленные на рис. 55 позволяют заключить, что внутривенное введение ФОП животным приводило к: а) активации клеток с супрессорным потенциалом, которые обладали антиген-специфическим супрессорным действием на КЧ; б) ФОП активировал клетки, которые обладали активаторным действием на чужеродный гаптен. Эти результаты качественно совпадали с эффектом ФОП при его пероральном введении мышам [5]. Таким образом, в настоящей работе выявлено, что специфичность супрессорного действия ФОП на КЧ не зависит от его способа введения животным. Однако, тип клеток с супрессорными свойствами на реакцию КЧ, индуцированных под действием ФОП, остался не ясным .

3.2.11 Выявление популяции клеток, ответственных за супрессорное действие продуктов фотоокисления псоралена В предыдущем разделе настоящего исследования показано, что введение ФОП сенсибилизированным мышам приводит к появлению в организме животных клеток, обладающих специфическими супрессорными свойствами на реакцию КЧ. Для выявления популяции клеток с супрессорными свойствами на реакцию КЧ были изучены эффекты ФОП на модели адоптивного переноса супрессии указанной реакции. При этом, в данных экспериментах сенсибилизированным мышам-реципиентам переносили различные популяции иммунокомпетентных клеток, полученных методами позитивной или негативной иммуномагнитной сепарации. Схема экспериментов представлена на рисунке 56 .

–  –  –

РЕЦИПИЕНТ

Рисунок 56. Выявление фенотипа клеток с супрессорным потенциалом на реакцию КЧ, генерируемых при действии ФОП in vivo (схема эксперимента) В первой серии экспериментов была изучена возможность проявления супрессорных свойств Т-клетками. Для этого мышей-доноров сенсибилизировали ДНФБ. Через 24 часа животным перорально или в/в вводили 0,5 мл ФОП и, через 120 часов выделяли спленоциты. Из суспензии спленоцитов методом позитивной иммуномагнитной сепарации и используя набор реактивов Dynabeads Mouse Pan T (Thy 1.2) выделяли CD3+ лимфоциты .

Сенсибилизированным сингенным мышам-реципиентам переносили в/в по 7х106 CD3+ лимфоцитов или суммарную фракцию спленоцитов (108 клеток) .

Через 1 час после переноса клеточной суспензии мышам-реципиентам наносили разрешающую дозу ДНФБ на ухо. Еще через 24 часа регистрировали интенсивность реакции КЧ. Были поставлены следующие контроли реакции

КЧ:

K- (отрицательный контроль): интактные мыши, получившие только аппликацию ДНФБ на ухо;

К+1 (положительный контроль без переноса спленоцитов):

сенсибилизированным ДНФБ мышам через 144 часа наносили разрешающую дозу гаптена на ухо, и через 24 часа регистрировали интенсивность реакции КЧ;

К+2 (положительный контроль при переносе суммарной фракции спленоцитов): сенсибилизированным мышам-реципиентам в/в вводили суммарную клеточную фракцию спленоцитов, полученных от сенсибилизированных доноров (108 клеток на мышь), получивших 0,5 мл ФБР с 1% этанола, через час наносили разрешающую дозу ДНФБ на ухо. Еще через 24 часа регистрировали интенсивность реакции КЧ .

(положительный контроль при переносе клеток):

K+3 CD3+ сенсибилизированным мышам-реципиентам в/в вводили 7х106 клеток CD3+ лимфоцитов полученных от сенсибилизированных мышей-доноров, получивших 0,5 мл ФБР с 1% этанола, через час наносили разрешающую дозу ДНФБ на ухо. Еще через 24 часа регистрировали интенсивность реакции КЧ .

На рисунке 57 видно, что перенос суммарной фракции спленоцитов от ДНФБ-сенсибилизированных доноров, получивших ФОП как per os так и в/в, угнетал реакцию КЧ у мышей ДНФБ-сенсибилизированных реципиентов на 90±4% и 87,5±5%, соответственно, по сравнению с группой положительного контроля К+2 .

Рисунок 57. Выявление фенотипа клеток, ответственных за супрессорное действие продуктов фотоокисления псоралена: роль CD3+ лимфоцитов .

K- (отрицательный контроль): интактные мыши, получившие только аппликацию ДНФБ на ухо;

К+1 (положительный контроль без переноса спленоцитов): сенсибилизированным ДНФБ мышам через 144 часа наносили разрешающую дозу гаптена на ухо, и через 24 часа регистрировали интенсивность реакции КЧ;

Без сепарации:

К+2 (положительный контроль на ДНФБ в переносе): перенос спленоцитов (108 клеток) от ДНФБ-сенсибилизированных мышей-доноров, получивших 0,5 мл ФБР с 1% этанола, сенсибилизированным ДНФБ мышам-реципиентам .

ФОП (темные столбцы): адоптивный перенос КЧ спленоцитами (108 клеток) сенсибилизированных мышей-доноров, получивших 0,5 мл ФОП per os или в/в (сплошные и заштрихованные столбцы соответственно) сенсибилизированным мышамреципиентам. #p0,03 по сравнению с К+2;

CD3+:

K+3 (адоптивный перенос КЧ CD3+-спленоцитами): сенсибилизированным мышамреципиентам в/в вводили 7х106 клеток CD3+ лимфоцитов полученных от сенсибилизированных мышей-доноров, получивших 0,5 мл ФБР с 1% этанола ФОП (темные столбцы): адоптивный перенос КЧ CD3+-спленоцитами (7х106 клеток) от сенсибилизированных мышей-доноров, получивших 0,5 мл ФОП per os или в/в (сплошные и заштрихованные столбцы соответственно) сенсибилизированным мышамреципиентам .

*p0,05 по сравнению K+3;

Перенос CD3+-клеток от мышей-доноров, получивших ФОП как per os так и в/в, также угнетал реакцию КЧ у мышей реципиентов, однако процент супрессии был меньше, и составлял 51±9% и 41±3% соответственно по сравнению с контрольной группой К+3. Данный факт свидетельствует о том, клетки с супрессорными свойствами на КЧ, генерированные под действием ФОП относятся к популяции CD3+ клеток, т.е. Т-лимфоцитов. Однако перенос таких CD3+ клеток с супрессорными свойствами не приводил к полноценному подавлению реакции КЧ у мышей-реципиентов. Согласно данным литературы известно, что макрофаги под действием некоторых агентов могут служить клетками, обладающими супрессорными свойствами в реакции КЧ [50]. Данный факт может служить объяснением неполной супрессии реакции КЧ при адоптивном переносе CD3+ лейкоцитов мышам реципиентам от мышей доноров, получивших ФОП (рисунок 57) .

Кроме того, известно, что роли регуляторных клеток (с супрессорными свойствами на КЧ) могут выполнять CD19+ B-лимфоциты [85]. В этой связи были проведены эксперименты по выявлению возможности индукции Bклеток с супрессорными свойствами под действием ФОП. Эксперименты проводили согласно схеме, приведенной на рисунке 56. Сенсибилизацию мышей доноров и выделение спленоцитов проводили в те же сроки, как описано выше в настоящем разделе. Спленоциты обрабатывали используя набор реактивов Dynabeads Pan B220. При выделении клеток методом позитивной иммуномагнитной сепарации получали CD45R/B220+ B-клетки .

По данным литературы фенотипом CD45R/B220+ обладают В-клетки, от ранних про-В клеток до зрелых В-клеток [8]. Используя подход негативной иммуномагнитной сепарации получали фракцию спленоцитов, не содержащую CD45R/B220+ клеток. Адоптивный перенос выделенных популяций клеток или суммарной фракции спленоцитов проводили согласно схеме, представленной на рисунке 56. На рисунке 58 видно, что перенос суспензии спленоцитов от мышей-доноров, получивших ФОП преорально или в/в (сплошные или заштрихованные столбцы соответственно) приводил к супресии реакции КЧ на 94±5% и 81±4% соответственно. Напротив, перенос CD45R/B220+ клеток B-клеток полученных от мышей доноров получивших ФОП per os или в/в не влиял на реакцию КЧ у мышей реципиентов (рис. 58) .

Рисунок 58. Выявление фенотипа клеток, ответственных за супрессорное действие продуктов фотоокисления псоралена: роль CD45R/В220+ субпопуляции .

K- (отрицательный контроль): интактные мыши, получившие только аппликацию ДНФБ на ухо;

К+1 (положительный контроль без переноса спленоцитов): сенсибилизированным ДНФБ мышам через 144 часа наносили разрешающую дозу гаптена на ухо, и через 24 часа регистрировали интенсивность реакции КЧ;

Без сепарации:

К+2 (положительный контроль на ДНФБ в переносе): сенсибилизированным мышамреципиентам в/в вводили суммарную клеточную фракцию спленоцитов, полученных от сенсибилизированных доноров (108 клеток на мышь), получивших 0,5 мл ФБР с 1% этанола, через час наносили разрешающую дозу ДНФБ на ухо. Еще через 24 часа регистрировали интенсивность реакции КЧ .

ФОП (темные столбцы) адоптивный перенос КЧ спленоцитами: сенсибилизированным мышам-реципиентам в/в вводили суммарную клеточную фракцию спленоцитов, полученных от сенсибилизированных доноров (108 клеток на мышь), получивших 0,5 мл ФОП per os или в/в (сплошные и заштрихованные столбцы соответственно). *p0,05 и #p 0,03 по сравнению K+2;

Не В-клетки:

K+3 (адоптивный перенос КЧ спленоцитами без CD45R/В220 клеток):

сенсибилизированным мышам-реципиентам в/в вводили по 7х106 CD45R/В220- клеток, полученных от сенсибилизированных доноров получивших 0,5 мл ФБР с 1% этанола .

ФОП (темные столбцы) - адоптивный перенос КЧ спленоцитами с фенотипом CD45R/В220-: сенсибилизированным мышам-реципиентам в/в вводили по 7х106 CD45R/В220- клеток, полученных от сенсибилизированных доноров получивших 0,5 мл ФОП per os или в/в (сплошные и заштрихованные столбцы соответственно). #p 0,03 по сравнению K+3;

В-клетки:

K+ (адоптивный перенос КЧ CD45R/В220+ спленоцитами): сенсибилизированным мышам-реципиентам в/в вводили по 7х106 CD45R/В220+ клеток, полученных от сенсибилизированных доноров получивших 0,5 мл ФБР с 1% этанола .

ФОП (темные столбцы) - адоптивный перенос КЧ спленоцитами с фенотипом CD45R/В220+: сенсибилизированным мышам-реципиентам в/в вводили по 7х106 CD45R/В220+ клеток, полученных от сенсибилизированных доноров получивших 0,5 мл ФОП per os или в/в (сплошные и заштрихованные столбцы соответственно). * - p0,05; #

- p0,03;

На основании результатов, полученных в настоящем разделе можно заключить, что клетки с супрессорными свойствами, генерируемые под действием ФОП in vivo относятся преимущественно к популяции Т-клеток.В разделе 3.2.9 настоящей работы было показано, что клетками-эффекторами реакции КЧ к ДНФБ выступают CD8+ лимфоциты. Исходя из этого, можно утверждать, что клетками, обладающими супрессорными свойствами на реакцию КЧ к ДНФБ, генерируемые под действием ФОП являются CD4+ Тлимфоциты. Возможно, такие Т-клетки могут иметь фенотип CD4+/25+, как это было показано для фотофереза [52]. Однако, для подтверждения этой гипотезы необходимы дополнительные эксперименты, например с адоптивным переносом клеток. Таким образом, методом CD4+/25+ адоптивного переноса в настоящем исследовании было показано, что тип клеток с супрессорными свойствами, генерируемых под действием ФОП сходен с таковыми для фотофереза .

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Фотохимиотерапия на основе псораленов (ПУВА-терапия и фотоферез) используется для лечения широкого ряда кожных и аутоиммунных заболеваний, таких как аллергический контактный дерматит, витилиго, псориаз и др [14]. Несмотря на эффективность данной терапии фотохимические и иммунные механизмы ее действия остаются предметом дискуссий. При проведении ПУВА-терапии или фотофереза в тканях пациента происходит фотолиз красителя с последующим образованием продуктов его фотоокисления (ФОП) [15]. Вклад ФОП в действие псораленовой фотохимиотерапии до конца не ясен. В связи с вышесказанным, изучение закономерностей образования биологическиактивных ФОП-продуктов представляет большой научный и практический интерес .

Ранее было показано, что под действием УФА в растворе псоралена образуются по крайней мере несколько десятков ФОП-продуктов. Изучая свойства такой сложной смеси, было получено, что ФОП-продукты способны вызывать, по крайней мере, два типа эффектов: а) иммуномодулирующий (выявлен в реакции КЧ или ГЗТ); б) мембранотоксический (продемонстрирован на модели гемолиза). Какие именно из этих эффектов будет проявлять раствор ФОП, зависит от интенсивности действующего света при облучении раствора псоралена. Известно, что мембранотоксическими эффектами обладают растворы ФОП, полученные при высокой (свыше 180 Вт/м2) интенсивности действующего света, а Вт/м2) .

иммуномодулирующими – при низкой (до 40 Изучая мембранотоксические свойства ФОП на модели гемолиза раннее было предположено, что за разрушение мембраны могут быть ответственны агрегаты фотопродуктов псоралена, однако на тот момент методов, чтобы их обнаружить не существовало .

В настоящей работе методом РСР, позволяющим селективно обнаруживать агрегаты красителей, было получено несколько косвенных признаков того, что агрегатобразование может служить объяснением ФОПгемолиза. В дополнение, было показано, что ФОП-гемолиз и ФОПиндуцированный апоптоз лимфоцитов имеют сходные зависимости от величины интенсивности действующего света при облучении раствора псоралена. При этом иммуносупрессорные свойства ФОП, по-видимому, никак не связаны с его способностью к агрегации и к индукции апоптоза .

В настоящей работе было изучено действие ФОП на Т-клеточное звено иммунитета. Известно, что супрессия этого звена лежит в основе терапевтических эффектов псораленов [86]. В этой связи исследования в моделях Т-клеточного иммунного ответа, одной из которых является реакция КЧ, позволяют приблизиться к пониманию, во-первых, иммунных механизмов псораленовой фотохимиотерапии (ПУВА-терапии и фотофереза), и, во-вторых получить представление об иммунотропном действии ФОП .

Так в данной работе было показано, что введение ФОП ДНФБсенсибилизированным мышам приводило к снижению пролиферативной активности клеток ЛУ последних. Было продемонстрировано, что такое снижение пролиферации имеет под собой цитокиновую природу, заключающееся в том, что ФОП обладает модулирующим влиянием на продукцию секреторных цитокинов клетками лимфатических узлов ДНФБсенсибилизированных мышей. ФОП снижал продукцию ИЛ-2 лимфоцитами

– Th1-цитокина, который, по данным литературы, ответственен за усиление пролиферации иммунокомпетентных клеток при развитии реакции КЧ [36] .

Также было показано, что ФОП подавляет секрецию лимфоцитами таких провоспалительных цитокинов как ИЛ-4 и ИФН-, тем самым свидетельствуя о его возможности нарушать процесс дифференцировки CD8+-лимфоцитов в Тс1- и Тс2-субпопуляции. В дополнение, было обнаружено, что под действием ФОП генерируется пул клеток, по-видимому, относящийся к субпопуляции, и может являться ответственным за CD3+/CD4+ иммуносупрессорное действие ФОП .

В настоящей работе было обнаружено проапоптотическое действие ФОП in vitro как на интактные, так и на ДНФБ-сенсибилизированные лимфоциты мышей. Тем не менее, выявленные проапоптотические свойства ФОП, вероятнее всего, не могут служить объяснением иммуносупрессорного действия последнего на реакцию КЧ. Это заключение, во-первых, основано на том, что интактные лимфоциты были сильнее подвержены проапоптотическому действию ФОП, нежели клетки ДНФБсенсибилизированных животных. Во-вторых, ФОП индуцировал апоптоз лимфоцитов более эффективно при высоких интенсивностях облучения псоралена, чем при низких. Согласно же данным литературы [46], уменьшение интенсивности действующего света при облучении псоралена должно приводить к увеличению выхода ФОП-продуктов с иммуносупрессорными свойствами .

Таким образом, результаты данной работы показывают, что продукты фотоокисления псоралена обладают иммунорегуляторными свойствами и механизмы их иммуносупрессорного действия в некоторых чертах сходны с таковыми для псораленовой фотохимиотерапии. Полученные результаты позволяют приблизиться к пониманию иммуносупрессорного действия ФОП и тем самым дать предпосылки для разработки нового способа псораленовой фотохимиотерапии – ФОП-терапии. Преимущество ФОП-терапии перед традиционной псораленовой фотохимиотерапией заключается в отсутствии необходимости УФА-воздействия на ткани пациента, что позволит исключить развитие различных побочных токсических эффектов, связанных с повреждением ДНК [25] .

ВЫВОДЫ

1) Обнаруженная методом резонансного светорассеяния (РСР) фотоиндуцированная агрегация продуктов фотоокисления псоралена (ФОП) усиливается при увеличении концентрации псоралена, а также при увеличении интенсивности действующего света .

2) Обнаружено, что фотоиндуцированная агрегация ФОП происходит как в присутствии кислорода, так и в атмосфере аргона. Причем при равных дозах облучения сигнал РСР в бескислородных условиях превышает таковой при облучении на воздухе примерно в два раза. В отличие от этого фотопродукты, вызывающие гемолиз, образуются только на воздухе, т.е .

способностью вызывать гемолиз обладают только продукты фотоокисления псоралена (ФОП-гемолизины) .

3) Выявлено, что введение ФОП приводит к уменьшению накопления ДНФБспецифических клеток как в лимфоузлах, так и в селезенках мышей, а также приводит к снижению пролиферации клеток ЛУ и модуляции цитокинового профиля лимфоцитов, принимающих участие в развитии КЧ, а именно:

уменьшению продукции ИЛ-2, ИЛ-4 и ИФН-, и увеличению синтеза ИЛ-17 .

4) Показано, что ФОП in vitro индуцирует апоптоз клеток ЛУ, полученных как от интактных, так и от ДНФБ-сенсибилизированных мышей .

Образование ФОП-продуктов с проапототическими свойствами зависело от интенсивности действующего света. При этом дозовые зависимости для ФОП-индуцированного апоптоза и ФОП-агрегации имеют схожий характер .

5) Выявлено, что клетки с супрессорным действием на реакцию КЧ, индуцированные под действием ФОП in vivo, относятся преимущественно к субпопуляции CD3+ Т-лимфоцитов .

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Владимиров, Ю.А. Физико-химические основы фотобиологических процессов / Ю.А .

Владимиров, А.Я. Потапенко. Дрофа, 2006. –– 65 с .

2. Козлов, И.Г. Новый подход к псораленовой фотохимиотерапии, исключающий облучение кожи пациентов ультрафиолетовым светом / И.Г. Козлов, Н.А. Ларина, М.Б .

Неклюкова, А.Я. Потапенко, Ч.Р. Саха-Меллер, В. Адам, Н.К. Горлина, Н.К. Чередеев, А.А. Кягова // Успехи клинической иммунологии и аллергологии. – 2001.– №2. – C. 277Лысенко, Е.П. Фотофизические свойства и фотоокислительные реакции фурокумаринов в растворах биомембранах: дис. … канд. биол. наук: 03.00.02 / Лысенко Евгений Петрович. –– М., 1991. 155-175 с .

4. Потапенко, А.Я. Биофизические проблемы фотомедицины в дерматологии. А.Я .

Потапенко, А.А. Кягова // Дерматовенерология. Национальное руководство, под редакцией Бутова Ю.С. Скрипкина Ю.К., Иванова О.Л. М. : ГЭОТАР-Медиа, 2011. — 111-121 с .

5. Потапенко, А.Я. Фотобиофизика фурокумаринов / А.Я. Потапенко, М.В. Малахов, А.А .

Кягова // Биофизика – 2004.– №49. – C. 322-339 .

6. Хаитов Р.М. Иммунология: учебник / P.M. Хаитов, Г.Л. Игнатьева, И.Г. Сидорович – М.: Медицина, 2000. – 25 с .

7. Хайдуков, С.В. Вопросы современной проточной цитометрии. Клиническое применение / С.В. Хайдуков, А.В. Зурочка – Челябинск: Бумаж. Двор, 2008. – 26 с .

8. Ahn, G. Immunomodulatory effects of an enzymatic extract from Ecklonia cava on murine splenocytes / G. Ahn, I. Hwang, E. Park, J. Kim, Y.J. Jeon, J. Lee, J.W. Park, Y. Jee // Mar Biotechnol (NY) – 2008.– №10. – C. 278-289 .

9. Aubin, F. Local suppression of contact hypersensitivity in mice by a new bifunctional psoralen, 4,4',5'-trimethylazapsoralen, and UVA radiation / F. Aubin, F. Dall'Acqua, M.L .

Kripke // J Invest Dermatol – 1991.– №97. – C. 50-54 .

10. Belichenko, V. Comparison of haemolytic effects of butilated hydroxytoluene and previously photooxidized psoralen / V. Belichenko, E.P. Lysenko, N.N. Zhuravel, A.A. Kyagova, A.Y .

Potapenko // Phys. Chem. Biol. & Med – 1995.– №2. – C. 159-164 .

11. Besaratinia, A. Biological consequences of 8-methoxypsoralen-photoinduced lesions:

sequence-specificity of mutations and preponderance of T to C and T to a mutations / A .

Besaratinia, G.P. Pfeifer // J Invest Dermatol – 2004.– №123. – C. 1140-1146 .

12. Biedermann, T. Mast cells control neutrophil recruitment during T cell-mediated delayedtype hypersensitivity reactions through tumor necrosis factor and macrophage inflammatory protein 2 / T. Biedermann, M. Kneilling, R. Mailhammer, K. Maier, C.A. Sander, G. Kollias, S.L. Kunkel, L. Hultner, M. Rocken // J Exp Med – 2000.– №192. – C. 1441-1452 .

13. Bladon, J. Extracorporeal photopheresis: a focus on apoptosis and cytokines / J. Bladon, P.C .

Taylor // J Dermatol Sci – 2006.– №43. – C. 85-94 .

14. Bulat, V. The mechanisms of action of phototherapy in the treatment of the most common dermatoses / V. Bulat, M. Situm, I. Dediol, I. Ljubicic, L. Bradic // Coll Antropol – 2011.– №35 Suppl 2. – C. 147-151 .

15. Caffieri, S. Furocoumarin photolysis: chemical and biological aspects / S. Caffieri // Photochem Photobiol Sci – 2002.– №1. – C. 149-157 .

16. Caffieri, S. The mitochondrial effects of novel apoptogenic molecules generated by psoralen photolysis as a crucial mechanism in PUVA therapy / S. Caffieri, F. Di Lisa, F. Bolesani, M .

Facco, G. Semenzato, F. Dall'Acqua, M. Canton // Blood – 2007.– №109. – C. 4988-4994 .

17. Cavani, A. Immune regulatory mechanisms in allergic contact dermatitis and contact sensitization / A. Cavani // Chem Immunol Allergy – 2008.– №94. – C. 93-100 .

18. Christensen, A. Immunological mechanisms of contact hypersensitivity in mice / A.D .

Christensen, C. Haase // APMIS – 2012.– №120. – C. 1-27 .

19. Coimbra, S. Interleukin (IL)-22, IL-17, IL-23, IL-8, vascular endothelial growth factor and tumour necrosis factor-alpha levels in patients with psoriasis before, during and after psoralenultraviolet A and narrowband ultraviolet B therapy / S. Coimbra, H. Oliveira, F. Reis, L. Belo, S .

Rocha, A. Quintanilha, A. Figueiredo, F. Teixeira, E. Castro, P. Rocha-Pereira, A. Santos-Silva // Br J Dermatol – 2010.– №163. – C. 1282-1290 .

20. Craw, M. Some photophysical properties of 3-carbethoxypsoralen, 8-methoxypsoralen and 5methoxypsoralen triplet states / M. Craw, R.V. Bensasson, J.C. Ronfard-Haret, M.T. Sa e Melo, T.G. Truscott // Photochem Photobiol – 1983.– №37. – C. 611-615 .

21. Dearman, R. Allergen-induced cytokine phenotypes in mice: role of CD4 and CD8 T cell populations / R.J. Dearman, N. Humphreys, R.A. Skinner, I. Kimber // Clin Exp Allergy – 2005.– №35. – C. 498-505 .

22. Demchenko, A. Beyond annexin V: fluorescence response of cellular membranes to apoptosis / A.P. Demchenko // Cytotechnology – 2013.– №65. – C. 157-172 .

23. Dudeck, A. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens / A. Dudeck, J. Dudeck, J. Scholten, A. Petzold, S. Surianarayanan, A. Kohler, K .

Peschke, D. Vohringer, C. Waskow, T. Krieg, W. Muller, A. Waisman, K. Hartmann, M .

Gunzer, A. Roers // Immunity – 2011.– №34. – C. 973-984 .

24. Edelson, B. Peripheral CD103+ dendritic cells form a unified subset developmentally related to CD8alpha+ conventional dendritic cells / B.T. Edelson, W. Kc, R. Juang, M. Kohyama, L.A .

Benoit, P.A. Klekotka, C. Moon, J.C. Albring, W. Ise, D.G. Michael, D. Bhattacharya, T.S .

Stappenbeck, M.J. Holtzman, S.S. Sung, T.L. Murphy, K. Hildner, K.M. Murphy // J Exp Med – 2010.– №207. – C. 823-836 .

25. Efferth, T. Induction of apoptosis, depletion of glutathione, and DNA damage by extracorporeal photochemotherapy and psoralen with exposure to UV light in vitro / T. Efferth, U. Fabry, R. Osieka // Anticancer Res – 2001.– №21. – C. 2777-2783 .

26. Furuhashi, T. Photo(chemo)therapy reduces circulating Th17 cells and restores circulating regulatory T cells in psoriasis / T. Furuhashi, C. Saito, K. Torii, E. Nishida, S. Yamazaki, A .

Morita // PLoS One – 2013.– №8. – C. e54895 .

27. Gaffen, S. Recent advances in the IL-17 cytokine family / S.L. Gaffen // Curr Opin Immunol

– 2011.– №23. – C. 613-619 .

28. George, J. Role for CD4(+)CD25(+) T cells in inhibition of graft rejection by extracorporeal photopheresis / J.F. George, C.W. Gooden, L. Guo, J.K. Kirklin // J Heart Lung Transplant – 2008.– №27. – C. 616-622 .

29. Gollnick, S. IL-10 does not play a role in cutaneous Photofrin photodynamic therapy-induced suppression of the contact hypersensitivity response / S.O. Gollnick, D.A. Musser, A.R. Oseroff, L. Vaughan, B. Owczarczak, B.W. Henderson // Photochem Photobiol – 2001.– №74. – C. 811Grabbe, S. Removal of the majority of epidermal Langerhans cells by topical or systemic steroid application enhances the effector phase of murine contact hypersensitivity / S. Grabbe, K .

Steinbrink, M. Steinert, T.A. Luger, T. Schwarz // J Immunol – 1995.– №155. – C. 4207-4217 .

31. Guan, H. GammadeltaT cells regulate the development of hapten-specific CD8+ effector T cells in contact hypersensitivity responses / H. Guan, G. Zu, M. Slater, C. Elmets, H. Xu // J Invest Dermatol – 2002.– №119. – C. 137-142 .

32. Gutting, B. Oxazolone and diclofenac-induced popliteal lymph node assay reactions are attenuated in mice orally pretreated with the respective compound: potential role for the induction of regulatory mechanisms following enteric administration / B.W. Gutting, F .

Bouzahzah, P.L. Kong, L.W. Updyke, D.E. Amacher, J. Craft // Toxicol Appl Pharmacol – 2003.– №189. – C. 120-133 .

33. Hannani, D. Photochemotherapy induces the apoptosis of monocytes without impairing their function / D. Hannani, F. Gabert, D. Laurin, M. Sall, J.P. Molens, O. Hequet, L. Chaperot, J .

Plumas // Transplantation – 2010.– №89. – C. 492-499 .

34. He, D. IL-17 and IFN-gamma mediate the elicitation of contact hypersensitivity responses by different mechanisms and both are required for optimal responses / D. He, L. Wu, H.K. Kim, H .

Li, C.A. Elmets, H. Xu // J Immunol – 2009.– №183. – C. 1463-1470 .

35. Heald, P. T-cell responses in photoimmune therapy / P.W. Heald, H.Y. Kim, M. Perez, R.L .

Edelson, C.L. Berger // J Clin Apher – 1995.– №10. – C. 144-149 .

36. Honda, T. Update of immune events in the murine contact hypersensitivity model: toward the understanding of allergic contact dermatitis / T. Honda, G. Egawa, S. Grabbe, K. Kabashima // J Invest Dermatol – 2013.– №133. – C. 303-315 .

37. Honda, T. Compensatory role of Langerhans cells and langerin-positive dermal dendritic cells in the sensitization phase of murine contact hypersensitivity / T. Honda, S. Nakajima, G .

Egawa, K. Ogasawara, B. Malissen, Y. Miyachi, K. Kabashima // J Allergy Clin Immunol – 2010.– №125. – C. 1154-1156 e1152 .

38. Igyarto, B. Langerhans cells suppress contact hypersensitivity responses via cognate CD4 interaction and langerhans cell-derived IL-10 / B.Z. Igyarto, M.C. Jenison, J.C. Dudda, A. Roers, W. Muller, P.A. Koni, D.J. Campbell, M.J. Shlomchik, D.H. Kaplan // J Immunol – 2009.– №183. – C. 5085-5093 .

39. Kabashima, K. Prostaglandin E2-EP4 signaling initiates skin immune responses by promoting migration and maturation of Langerhans cells / K. Kabashima, D. Sakata, M .

Nagamachi, Y. Miyachi, K. Inaba, S. Narumiya // Nat Med – 2003.– №9. – C. 744-749 .

40. Kovalskaya, M. The nature of electronically exited states and photoprocesses in psoralen molecules and their complexes / M. Kovalskaya, J. Sokolova // High Energy Chem – 2002.– №36. – C. 237-240 .

41. Kubo, A. External antigen uptake by Langerhans cells with reorganization of epidermal tight junction barriers / A. Kubo, K. Nagao, M. Yokouchi, H. Sasaki, M. Amagai // J Exp Med – 2009.– №206. – C. 2937-2946 .

42. Kyagova, A. Specific suppression of contact hypersensitivity in mice by photolysis products of psoralens / A. Kyagova, Z. Moshnina, L. Kozir, O. Glazunova, M. Moshnin, A. Potapenko // J. Invest. Dermatol. – 2006.– №126, Suppl. 3. – C. 79 .

43. Kyagova, A. Immunosuppression caused by photochemo-and photodynamic therapy: focus on photosensitizer photoproducts / A.A. Kyagova, M.V. Malakhov, A.Ya Potapenko // Immunosupression: new research - 2009.–– C. 167-183 .

44. Kyagova, A. Modulation of delayed type hypersensitivity in mice treated with photoproducts of various photosensitizers used in photodynamic therapy / A.A. Kyagova, L.A. Kozir, G.V .

Mansurova, V.P. Zorin, L.N. Bezdetnaya, F. Guillemin, A.Y. Potapenko // Russ J Immunol – 2002.– №7. – C. 327-334 .

45. Kyagova, A. The Attenuation of Effectors and Induction of Suppressors of Delayed Type Hypersensitivity Reaction under the Treatment with Psoralen Photooxidation Products / A.A .

Kyagova, E.N. Nagurskaya, V.A. Bekhalo, I.Y. Chernyakhovskaya, I.V. Belichenko, A.Y .

Potapenko // Russ J Immunol – 1996.– №1. – C. 61-68 .

46. Kyagova, A. Suppression of delayed-type hypersensitivity and hemolysis induced by previously photooxidized psoralen: effect of fluence rate and psoralen concentration / A.A .

Kyagova, N.N. Zhuravel, M.V. Malakhov, E.P. Lysenko, W. Adam, C.R. Saha-Moller, A .

Potapenko // Photochem Photobiol – 1997.– №65. – C. 694-700 .

47. Larsen, J. Cellular dynamics in the draining lymph nodes during sensitization and elicitation phases of contact hypersensitivity / J.M. Larsen, C. Geisler, M.W. Nielsen, L. Boding, M. Von Essen, A.K. Hansen, L. Skov, C.M. Bonefeld // Contact Dermatitis – 2007.– №57. – C. 300-308 .

48. Lepoittevin J. Metabolism versus chemical transformation or pro- versus prehaptens? / J.P .

Lepoittevin // Contact Dermatitis – 2006.– №54. – C. 73-74 .

49. Luftl, M. PUVA inhibits DNA replication, but not gene transcription at nonlethal dosages / M. Luftl, M. Rocken, G. Plewig, K. Degitz // J Invest Dermatol – 1998.– №111. – C. 399-405 .

50. Lynch, D. Systemic immunosuppression induced by photodynamic therapy (PDT) is adoptively transferred by macrophages / D.H. Lynch, S. Haddad, V.J. King, M.J. Ott, R.C .

Straight, C.J. Jolles // Photochem Photobiol – 1989.– №49. – C. 453-458 .

51. Maeda, A. Experimental extracorporeal photopheresis inhibits the sensitization and effector phases of contact hypersensitivity via two mechanisms: generation of IL-10 and induction of regulatory T cells / A. Maeda, A. Schwarz, A. Bullinger, A. Morita, D. Peritt, T. Schwarz // J Immunol – 2008.– №181. – C. 5956-5962 .

52. Maeda, A. Intravenous infusion of syngeneic apoptotic cells by photopheresis induces antigen-specific regulatory T cells / A. Maeda, A. Schwarz, K. Kernebeck, N. Gross, Y .

Aragane, D. Peritt, T. Schwarz // J Immunol – 2005.– №174. – C. 5968-5976 .

53. Martin, S. Toll-like receptor and IL-12 signaling control susceptibility to contact hypersensitivity / S.F. Martin, J.C. Dudda, E. Bachtanian, A. Lembo, S. Liller, C. Durr, M.M .

Heimesaat, S. Bereswill, G. Fejer, R. Vassileva, T. Jakob, N. Freudenberg, C.C. Termeer, C .

Johner, C. Galanos, M.A. Freudenberg // J Exp Med – 2008.– №205. – C. 2151-2162 .

54. McMinn, P. Effects of gliotoxin on Langerhans' cell function: contact hypersensitivity responses and skin graft survival / P.C. McMinn, G.M. Halliday, H.K. Muller // Immunology – 1990.– №71. – C. 46-51 .

55. Moniaga, C. Flaky tail mouse denotes human atopic dermatitis in the steady state and by topical application with Dermatophagoides pteronyssinus extract / C.S. Moniaga, G. Egawa, H .

Kawasaki, M. Hara-Chikuma, T. Honda, H. Tanizaki, S. Nakajima, A. Otsuka, H. Matsuoka, A .

Kubo, J. Sakabe, Y. Tokura, Y. Miyachi, M. Amagai, K. Kabashima // Am J Pathol – 2010.– №176. – C. 2385-2393 .

56. Montoya, M. Cell adhesion and polarity during immune interactions / M.C. Montoya, D .

Sancho, M. Vicente-Manzanares, F. Sanchez-Madrid // Immunol Rev – 2002.– №186. – C. 68Nakae, S. Interleukin-1 beta, but not interleukin-1 alpha, is required for T-cell-dependent antibody production / S. Nakae, M. Asano, R. Horai, Y. Iwakura // Immunology – 2001.– №104 .

– C. 402-409 .

58. Otsuka, A. Requirement of interaction between mast cells and skin dendritic cells to establish contact hypersensitivity / A. Otsuka, M. Kubo, T. Honda, G. Egawa, S. Nakajima, H. Tanizaki, B. Kim, S. Matsuoka, T. Watanabe, S. Nakae, Y. Miyachi, K. Kabashima // PLoS One – 2011.– №6. – C. e25538 .

59. Parkash, J. Depolarized resonance light scattering by porphyrin and chlorophyll a aggregates / J. Parkash, J.H. Robblee, J. Agnew, E. Gibbs, P. Collings, R.F. Pasternack, J.C. de Paula // Biophys J – 1998.– №74. – C. 2089-2099 .

60. Pasternack, R. Resonance light scattering: a new technique for studying chromophore aggregation / R.F. Pasternack, P.J. Collings // Science – 1995.– №269. – C. 935-939 .

61. Pathak, M. Molecular aspects of drug photosensitivity with special emphasis on psoralen photosensitization reaction / M.A. Pathak // J Natl Cancer Inst – 1982.– №69. – C. 163-170 .

62. Peiser, M. Allergic contact dermatitis: epidemiology, molecular mechanisms, in vitro methods and regulatory aspects. Current knowledge assembled at an international workshop at BfR, Germany / M. Peiser, T. Tralau, J. Heidler, A.M. Api, J.H. Arts, D.A. Basketter, J. English, T.L. Diepgen, R.C. Fuhlbrigge, A.A. Gaspari, J.D. Johansen, A.T. Karlberg, I. Kimber, J.P .

Lepoittevin, M. Liebsch, H.I. Maibach, S.F. Martin, H.F. Merk, T. Platzek, T. Rustemeyer, A .

Schnuch, R.J. Vandebriel, I.R. White, A. Luch // Cell Mol Life Sci – 2012.– №69. – C. 763-781 .

63. Pooler, J. The kinetics of colloid osmotic hemolysis. II. Photohemolysis / J.P. Pooler // Biochim Biophys Acta – 1985.– №812. – C. 199-205 .

64. Potapenko, A. Mechanisms of photodynamic effects of furocoumarins / A. Potapenko // J Photochem Photobiol B – 1991.– №9. – C. 1-33 .

65. Potapenko, A. Photohemolysis sensitized by psoralen: reciprocity law is not fulfilled / A .

Potapenko, M.A. Agamalieva, A.I. Nagiev, E.P. Lysenko, L.N. Bezdetnaya, V.L. Sukhorukov // Photochem Photobiol – 1991.– №54. – C. 375-379 .

66. Potapenko, A. Products of psoralen photooxidation possess immunomodulative and antileukemic effects / A. Potapenko, A.A. Kyagova, L.N. Bezdetnaya, E.P. Lysenko, I .

Chernyakhovskaya, V.A. Bekhalo, E.V. Nagurskaya, V.A. Nesterenko, N.G. Korotky, S.N .

Akhtyamov, et al. // Photochem Photobiol – 1994.– №60. – C. 171-174 .

67. Potapenko, A. Photosensitized modification of erythrocyte membranes induced by furocoumarins / Potapenko A.Ya., Wunderlich S., Bezdetnaya L.N., S. V.L. // Photobiochem .

Photobiophys. – 1986.– №10. – C. 175-180 .

68. Punnonen, K. Effects of in vitro UVA irradiation and PUVA treatment on membrane fatty acids and activities of antioxidant enzymes in human keratinocytes / K. Punnonen, C.T. Jansen, A. Puntala, M. Ahotupa // J Invest Dermatol – 1991.– №96. – C. 255-259 .

69. Ring, S. CD4+ CD25+ regulatory T cells suppress contact hypersensitivity reactions by blocking influx of effector T cells into inflamed tissue / S. Ring, S.C. Schafer, K. Mahnke, H.A .

Lehr, A.H. Enk // Eur J Immunol – 2006.– №36. – C. 2981-2992 .

70. Rosado-Schlosser, B. The reciprocity rule in photobiology - a review / B. Rosado-Schlosser, Trautinger, F. // Journal - 2010.– – C .

71. Saint-Mezard, P. The role of CD4+ and CD8+ T cells in contact hypersensitivity and allergic contact dermatitis / P. Saint-Mezard, F. Berard, B. Dubois, D. Kaiserlian, J.F. Nicolas // Eur J Dermatol – 2004.– №14. – C. 131-138 .

72. Schmidt, M. Crucial role for human Toll-like receptor 4 in the development of contact allergy to nickel / M. Schmidt, B. Raghavan, V. Muller, T. Vogl, G. Fejer, S. Tchaptchet, S .

Keck, C. Kalis, P.J. Nielsen, C. Galanos, J. Roth, A. Skerra, S.F. Martin, M.A. Freudenberg, M .

Goebeler // Nat Immunol – 2010.– №11. – C. 814-819 .

73. S. Schmitt, S. Extracorporeal photophoresis augments function of CD4+CD25+FoxP3+ regulatory T cells by triggering adenosine production / S. Schmitt, T.S. Johnson, S .

Karakhanova, H. Naher, K. Mahnke, A.H. Enk // Transplantation – 2009.– №88. – C. 411-416 .

74. Serrano-Perez, J. Photoreactivity of furocoumarins and DNA in PUVA therapy: formation of psoralen-thymine adducts / J.J. Serrano-Perez, M. Merchan, L. Serrano-Andres // J Phys Chem B

– 2008.– №112. – C. 14002-14010 .

75. Serrano-Perez, J. A theoretical insight into the photophysics of psoralen / J.J. Serrano-Perez, L. Serrano-Andres, M. Merchan // J Chem Phys – 2006.– №124. – C. 124502 .

76. Shornick, L. IL-1beta is essential for langerhans cell activation and antigen delivery to the lymph nodes during contact sensitization: evidence for a dermal source of IL-1beta / L.P .

Shornick, A.K. Bisarya, D.D. Chaplin // Cell Immunol – 2001.– №211. – C. 105-112 .

77. Simkin, G. IL-10 contributes to the inhibition of contact hypersensitivity in mice treated with photodynamic therapy / G.O. Simkin, J.S. Tao, J.G. Levy, D.W. Hunt // J Immunol – 2000.– №164. – C. 2457-2462 .

78. Singh, T. 8-Methoxypsoralen plus UVA treatment increases the proportion of CLA+ CD25+ CD4+ T cells in lymph nodes of K5.hTGFbeta1 transgenic mice / T.P. Singh, M.P. Schon, K .

Wallbrecht, P. Wolf // Exp Dermatol – 2012.– №21. – C. 228-230 .

79. M. Tsai, M. Using mast cell knock-in mice to analyze the roles of mast cells in allergic responses in vivo / M. Tsai, M.A. Grimbaldeston, M. Yu, S.Y. Tam, S.J. Galli // Chem Immunol Allergy – 2005.– №87. – C. 179-197 .

80. Vocanson, M. CD8+ T cells are effector cells of contact dermatitis to common skin allergens in mice / M. Vocanson, A. Hennino, M. Cluzel-Tailhardat, P. Saint-Mezard, J. Benetiere, C .

Chavagnac, F. Berard, D. Kaiserlian, J.F. Nicolas // J Invest Dermatol – 2006.– №126. – C. 815Voss, C. Extending the horizon for cell-based immunotherapy by understanding the mechanisms of action of photopheresis / C.Y. Voss, T.J. Fry, M.J. Coppes, M.A. Blajchman // Transfus Med Rev – 2010.– №24. – C. 22-32 .

82. Wang, L. Langerin expressing cells promote skin immune responses under defined conditions / L. Wang, L.S. Bursch, A. Kissenpfennig, B. Malissen, S.C. Jameson, K.A. Hogquist // J Immunol – 2008.– №180. – C. 4722-4727 .

83. Waszkowska, E. Spectroscopic detection of photoproducts in lecithin model system after 8methoxypsoralen plus UV-A treatment / E. Waszkowska, Z. Zarebska, J. Poznanski, I. Zhukov // J Photochem Photobiol B – 2000.– №55. – C. 145-154 .

84. Watanabe, H. Contact hypersensitivity: the mechanism of immune responses and T cell balance / H. Watanabe, M. Unger, B. Tuvel, B. Wang, D.N. Sauder // J Interferon Cytokine Res

– 2002.– №22. – C. 407-412 .

85. Watanabe, R. CD19 expression in B cells is important for suppression of contact hypersensitivity / R. Watanabe, M. Fujimoto, N. Ishiura, Y. Kuwano, H. Nakashima, N. Yazawa, H. Okochi, S. Sato, T.F. Tedder, K. Tamaki // Am J Pathol – 2007.– №171. – C. 560-570 .

86. Worel, N. Clinical Results of Extracorporeal Photopheresis / N. Worel, G. Leitner // Transfus Med Hemother – 2012.– №39. – C. 254-262 .

87. Xiao, C. Comprehensive study of the interaction between a potential antiprion cationic porphyrin and human prion protein at different pH by using multiple spectroscopic methods / C.Q. Xiao, B.Y. Feng, Y.S. Ge, X.Y. Fan, F.L. Jiang, G. Xiao, Y. Liu // J Pharm Sci – 2013.– №102. – C. 1076-1085 .

88. Yoo, E. Apoptosis induction of ultraviolet light A and photochemotherapy in cutaneous Tcell Lymphoma: relevance to mechanism of therapeutic action / E.K. Yoo, A.H. Rook, R .

Elenitsas, F.P. Gasparro, B.R. Vowels // J Invest Dermatol – 1996.– №107. – C. 235-242 .

89. Yurchenko, M. The multilevel regulation of CD95 signaling outcome / M. Yurchenko, L.M .

Shlapatska, S.P. Sidorenko // Exp Oncol – 2012.– №34. – C. 153-159 .

90. Suda, T. Physiological and pathological roles of apoptosis / T. Suda // Nippon Rinsho – 2005.– №63 Suppl 4. – C. 395-400 .

91. Tikhomirov, A. Investigation of aggregates of dyes by the method of resonance light scattering: correction of spectra / A.M. Tikhomirov, T.A. Shmigol, E.A. Kozhinova, A.A .

Kiagova, L.N. Bezdetnaia, A. Potapenko // Biofizika – 2009.– №54. – C. 824-830 .

92. Helewski, K. Apoptosis and necrosis--two different ways leading to the same target / K.J .

Helewski, G.I. Kowalczyk-Ziomek, J. Konecki // Wiad Lek – 2006.– №59. – C. 679-684 .



Похожие работы:

«Анализ Панорамы опыта работы МПК учителей биологии, химии, географии, самопознания, технологии и НВП. В гимназии №2 г. Хромтау с 23 ноября по 7 декабря 2017 гпрошла Панорама опыта работы МПИК учителей биологии, химии, геогра...»

«ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ "СТАВРОПОЛЬСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ" МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ КАФЕДРА БИОЛОГИИ МАКАРЕНКО Э.Н., ПОХОДЕНКО М.В., ХАЧАТУРОВА А.А. для бакалавр...»

«СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫЕ НАУКИ УДК 631.51:633.63 DOI: 10.17238/issn2071-2243.2016.3.32 ПОКАЗАТЕЛИ ПЛОДОРОДИЯ ЧЕРНОЗЕМОВ ПОД ВЛИЯНИЕМ ДЛИТЕЛЬНОГО ПРИМЕНЕНИЯ РАЗЛИЧНЫХ ОБРАБОТОК ПОЧВЫ И УДОБРЕНИЙ Татьяна Александровна Трофимова Сергей Иванович Коржов Александр Павлович Пичугин Геннадий В...»

«Министерство образования и науки Украины Одесский национальный политехнический университет Р.Т. Раевский, С.М. Канишевский ЗДОРОВЬЕ, ЗДОРОВЫЙ И ОЗДОРОВИТЕЛЬНЫЙ ОБРАЗ ЖИЗНИ СТУДЕНТОВ Одесса УДК 613 ББК 51.204.0 Р163 Рецензенты: Э.С. Вильчковский, доктор педагоги...»

«КИРОВСКАЯ ЛЕТНЯЯ МНОГОПРЕДМЕТНАЯ ШКОЛА (ЛМШ) ОБЪЯВЛЯЕТ НАБОР УЧАЩИХСЯ НА ИЮЛЬ 2011 ГОДА О ШКОЛЕ Что такое ЛМШ? Кировская ЛМШ основана в 1985 году и проводится с тех пор ежегодно. Это летний лагерь, где школьники сочетают отдых с интенсивными занятиями. В ЛМШ четыре потока — математический, физический, биологи...»

«МИНИСТЕРСТВО ПРИРОДНЫХ РЕСУРСОВ И ЭКОЛОГИИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ "ОБЪЕДИНЕННАЯ ДИРЕКЦИЯ МОРДОВСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО ПРИРОДНОГО ЗАПОВЕДНИКА ИМЕНИ П.Г. СМИДОВИЧА И НАЦИОНАЛЬНОГО ПАРКА "СМОЛЬНЫЙ" Посвящается 100-летию заповедной системы России ТРУДЫ МОРДОВСКОГО ГОСУ...»

«ЮЖНО-УРАЛЬСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ УТВЕРЖДАЮ: Директор филиала Филиал г. Нижневартовск _В. Н. Борщенюк 09.06.2017 РАБОЧАЯ ПРОГРАММА к ОП ВО от 03.11.2017 №007-03-1281 дисциплины Б.1.14 Статистика для направления 38.03.01 Экономика уровень бакалавр тип программы Академический бакалаври...»

«Содержание О Компании Ключевые события Основные показатели деятельности Обращение к акционерам Обзор результатов деятельности Лицензирование и запасы Геологоразведочные работы Разработка и обу...»

«РОЛЬ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО ТУРИЗМА В РАЗВИТИИ ВОСТОЧНОГО ЗАБАЙКАЛЬЯ Кондаурова А.С., Ковалева Н.М. Забайкальский государственный университет Чита, Россия Экологический туризм наиболее динамично развивающаяся отрасль мировой индустрии отдыха и развлечений. Это объясняется многими причинами: богатством рекреационных объектов, н...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ СИБИРСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АВТОМОБИЛЬНО-ДОРОЖНАЯ АКАДЕМИЯ (СИБАДИ) В.А. Хомич ЭКОЛОГИЯ ГОРОДСКОЙ СРЕДЫ Рекомендовано Учебно-методическим объединением Ассоциации строительных вузов в...»

«ЭКЗАМЕНАЦИОННЫЕ ВОПРОСЫ ПО МИКРОБИОЛОГИИ ДЛЯ СТУДЕНТОВ 3 КУРСА ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОГО ФАКУЛЬТЕТА (ОЧНОЕ ОТДЕЛЕНИЕ) (5 семестр, 2017-2018 учебный год) 1. Микробиология: определение, разделы, методы исследования. Задачи медицинской микробиологии. Значение микробиологии в деятельности провизора.2. Основные э...»

«126 ВЕСТНИК УДМУРТСКОГО УНИВЕРСИТЕТА 2012. Вып. 1 БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ Физико-географические исследования УДК 551.435.6 И.Е . Егоров, И.В. Глейзер МЕТОДИКА И РЕЗУЛЬТАТЫ ИЗУЧЕНИЯ ПРОЦЕССОВ ОСЫПАНИЯ...»

«УДК 575(076.1) ББК 28.04я73 С23 А в т о р ы: Н. П. Максимова (тема 8), М. А. Титок (темы 3, 5, 6, 10), В. С. Анохина (темы 3, 9, 10), Е. А. Храмцова (тема 7), В. В. Гринев (темы 3, 5, 6), М. П. Куницкая (те...»

«Полковник милиции в отставке Тюрин Иван Иванович, 03.09.1923 г. р. Тюрин И. И. родился в селе Березовка Анненского района Воронежской области. В 1941 году окончил среднюю школу. В марте 1942 года был призван в Красную армию и направлен служить на Дальневосточный фронт в мотострелков...»

«p. 103 ТАКСОНОМИЧЕСКОЕ ПОЛОЖЕНИЕ ВИДОВ, ОПИСАННЫХ В РОДЕ Tetrastichus Haliday, 1844 (s.l.) С ТЕРРИТОРИИ СССР, И ВЫДЕЛЕНИЕ НОВОГО РОДА Trjapitzinichus, gen. nov. Костюков В.В., Кошелева О.В.* Всероссийский НИИ биологической защиты растений Россельхо...»

«ЮЖНО-УРАЛЬСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ УТВЕРЖДАЮ Директор института Высшая медико-биологическая школа _В. Э. Цейликман 18.07.2017 РАБОЧАЯ ПРОГРАММА научных исследований к ОП ВО от 03.11.2017 №007-03-1394 Подготовка научно-квалификационной работы (диссертации) на соискание ученой с...»

«1 отзыв официального оппонента на диссертационную работу Букшук Натальи Александровны "Экологические особенности эндемичных губок озера Байкал: Распределение и жизненные циклы", предст...»

«Владимир Васильевич Меншуткин родился в 1930 году. В 1955 году окончил Ленинградский Кораблестроительный институт и работал в ЦНИИ им. акад. А. Н . Крылова в качестве ИСКУССТВО МОДЕЛИРОВАНИЯ инженера-исследователя. В 1958 году посВ. В. Меншуткин тупил в аспирантуру Сибирского отделения Академии наук СССР. В...»

«УТВЕРЖДАЮ Проректор-директор института Чайковский Д.В. "_"_2013 г. РАБОЧАЯ ПРОГРАММА МОДУЛЯ (ДИСЦИПЛИНЫ) ОСНОВЫ РЕСУРСОЭФФЕКТИВНОСТИ Направление (специальность) ООП Профиль(и) подготовки (специализация, программа) Квалификация (степень) Бакалавр, специа...»

«http://www.kudoist.ru Рациональное питание спортсменов. П.И. Пшендин ОБ АВТОРЕ Автор книги один из ведущих специалистов по биохимии и физиологии питания спортсменов, кандидат биологических наук Анатолий Иванович Пшендин. После окончания ЛГУ более 30...»

«Кафедра геоэкологии и геохимии Курс "Техногенные системы и экологический риск"• Лекция 12 • ПРИРОДНЫЕ РИСКИ И ОПАСНОСТИ • ОСИПОВА Н.А., • доцент кафедры ГЭГХ ПРИРОДНЫЕ РИСКИ И ОПАСНОСТИ Природные опасности • землетрясения • извержения вулканов • наводнения • ураганы и...»

«УТВЕРЖДАЮ Директор ИПР _Дмитриев А.Ю. "_"_2016 г. РАБОЧАЯ ПРОГРАММА ДИСЦИПЛИНЫ ГИДРОГЕОЛОГИЯ И ГИДРОЛОГИЯ НА УЧЕБНЫЙ 2016/2017 ГОД Направление (специальность) ООП 05.03.06 Экология и природопользование Профиль...»

«ГЛОБАЛЬНАЯ ЭНЕРГЕтИКА И УСтОйчИВОЕ РАЗВИтИЕ Мировая энергетика – 2050 (БеЛая книга) Международный центр v устойчивого энергетического развития под эгидой ЮНЕСКО (МЦУЭР) © 2011 v "Глобализация и Устойчивое развитие. ЗАО ИНСтИтУт ЭНЕРГЕтИчЕСКОй СтРАтЕГИИ" (ИЭС) © 2011 УДК 621.311.1 ББК 31 А 20 Глобальная э...»

«ПРОЕКТНАЯ ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ Скажи – и я забуду. Покажи – и я запомню. Вовлеки – и я научусь. Китайская пословица Локальные акты гимназии ВНЕУРОЧНАЯ ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ 5 класс 6 класс 7 класс 8 класс 9 класс "ПРОЕКТНАЯ "ОСНОВЫ ПРОЕКТНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ" ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ" 6 а класс – "Литературная гостиная" в память о погибших при блокаде Ленингр...»








 
2018 www.new.pdfm.ru - «Бесплатная электронная библиотека - собрание документов»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.